聚酰胺法富集人参根总黄酮工艺研究

张 儒，张变玲，谢 涛，李谷才，胡建昌，易 拓，蔡金红

(湖南工程学院 化学化工学院，湘潭 411104)



聚酰胺法富集人参根总黄酮工艺研究

张 儒，张变玲，谢 涛，李谷才，胡建昌，易 拓，蔡金红

(湖南工程学院 化学化工学院，湘潭 411104)

以总黄酮的质量分数为考察指标，通过聚酰胺树脂对人参根总黄酮静态和动态吸附与解吸附特性的研究，优化聚酰胺树脂对人参根总黄酮的富集工艺；并对优化的工艺进行验证，得到纯度高的人参根总黄酮.结果表明人参根总黄酮富集工艺为：室温、人参根总黄酮粗提物上样浓度为6 mg/mL、pH为10.0、洗脱液浓度80%乙醇、洗脱液流速1.5 mL/min，在该条件下富集3次，人参根总黄酮质量分数可由粗品的1.96%提高到48.38%.此法可较好的富集人参根总黄酮.

人参根总黄酮；聚酰胺树脂；富集

0 前 言

人参(Panax ginseng C.A.Meyer)为五加科人参属名贵药用植物，具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津、安神之功效.据报道，人参中含皂苷、多糖、黄酮、挥发油、生物碱、氨基酸等多种化学成分[1-2].近年来，对人参药用成分的研究主要集中在人参皂苷和人参多糖的药理活性方面[3].但作为人参重要成分之一的黄酮类化合物的研究却很少.

聚酰胺树脂是由酰胺聚合而成的一类高分子物质，它主要通过氢键和范德华力对黄酮类化合物进行吸附，已利用聚酰胺树脂从多种中药材中富集得到黄酮类化合物[4-6].

本研究组前期已经证实人参根黄酮类化合物具有很好的抗氧化活性[7].然而人参根黄酮类化合物含量很低，为了进一步提高人参根总黄酮粗提物中黄酮的纯度，利用聚酰胺树脂富集人参根中总黄酮，并对其富集工艺加以优化，期望探索出人参根总黄酮的高效富集工艺.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

4年生人参根采自吉林抚松，经湖南省药品检验所赵勇主管药师鉴定为人参(P. ginseng C.A. Meyer)；芦丁，中国药品生物制品检定所；聚酰胺树脂(30～60目、60～80目)、乙醇等试剂均为国产分析纯.

WND-200型高速中药粉粹机(浙江伟能达电器有限公司)；标准筛(杭州蓝天化验仪器厂)；BS323S电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；NH-4数显恒温水浴锅(国华电器有限公司)；RE-52A旋转蒸发器(巩义市英峪予华仪器厂)；UV-2102PCS型紫外-可见分光光度计(尤尼柯仪器有限公司).

1.2 聚酰胺树脂预处理

称取一定量的30～60目和60～80目两种聚酰胺树脂，用蒸馏水充分淋洗，95%乙醇浸泡24 h，过滤后用蒸馏水洗至树脂无醇味，再用4% NaOH溶液浸泡24 h，滤掉上层碱液，再以蒸馏水洗至中性，然后用4 mol/L盐酸浸泡24 h，再用蒸馏水洗至中性，备用.

1.3 人参根黄酮提取液的制备及含量测定

取新鲜人参根60 ℃烘干至水分含量低于0.5 %，粉碎后过20目筛.称取200.0 g，加入5 L 75%乙醇，65 ℃恒温水浴锅中提取2 h，收集滤液，滤渣重复上述操作3次，合并滤液；回收乙醇至干，分别用少量水溶解，并用正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取液并浓缩至干后，得到12.27 g人参黄酮粗提物干粉，再加水定容至500 mL(2.5 mL/g生药)，即人参黄酮粗提物.

[8]方法，精密称取经105 ℃干燥至恒重的芦丁对照品18.2 mg，加30%乙醇溶解，置100 mL容量瓶中，加30%乙醇定容至刻度，混匀.即得0.182 mg/mL芦丁标准溶液.精密吸取芦丁标准溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，置25 mL比色管中，分别加入30%乙醇10 mL，5%亚硝酸钠0.7 mL，混匀后放置6 min，再加入10%硝酸铝0.7 mL，6 min后加入10%氢氧化钠5 mL， 30%乙醇定容至10 mL，混匀后静置20 min，于510 nm波长下测定吸光度A值.以A值为纵坐标(y)，芦丁质量浓度为横坐标(x)，绘制标准曲线，得回归方程：y=0.018x+0.0497(r=0.999).结果表明：对照品在7.28～43.68 μg/mL之间具有良好的线性关系.以制作标准曲线的方法测定人参根提取物中总黄酮的含量.

1.4 聚酰胺树脂静态吸附与解吸附

取预处理好的不同目数的聚酰胺树脂各0.5 g，置于50 mL三角烧瓶中.加入4 mL浓度为0.48 mg/mL的总黄酮粗提物样品溶液，室温下震荡24 h后，过滤，测定滤液中总黄酮的浓度.计算聚酰胺树脂的吸附量和吸附率.吸附量=(初始质量浓度-剩余质量浓度)×溶液体积/树脂质量；吸附率(%)=[(初始质量浓度-剩余质量浓度)×溶液体积]/吸附样液中总黄酮含量×100%.

经静态饱和吸附后的树脂，滤出，吸干表面水分，转入三角烧瓶，再精密加入60%的乙醇20 mL，用震荡器震荡24 h后，过滤，测定滤液中总黄酮的浓度.计算解吸率.解吸率(%)=(解吸液浓度×解吸液体积)/吸附量×100%.

1.5 聚酰胺树脂富集人参根黄酮的工艺

1.5.1 聚酰胺树脂静态吸附条件优化

精密称取15份活化的60～80目聚酰胺树脂各0.5 g，分别置具塞三角瓶中，加入0.48 mg/mL人参根总黄酮粗提物溶液4 mL，分别在不同温度和pH条件下，180 r/min振荡12 h后收集3 mL上清液，取上清液1.0 mL(每组3个重复)，过滤，测定滤液中总黄酮的浓度.计算吸附量和吸附率.

1.5.2 聚酰胺树脂动态吸附条件优化

取预处理好的60～80目聚酰胺树脂，湿法装入内径为1.0 cm的色谱柱中，径高比为1∶10；室温下采用恒流泵，分析pH值为10.0、上样液浓度(2.0、4.0、6.0、8.0和10.0 mg/mL)和上样液流速(1～2.5 mL/min)对人参根黄酮吸附的影响，采用部分收集器收集流出液，每隔一定的时间(2 min)对流出液采用黄酮类化合物特异性显色反应盐酸-镁粉反应进行一次饱和检验，如有饱和反应则停止吸附.计算吸附量及吸附率.

1.5.3 聚酰胺树脂动态解吸附条件优化

考虑到所洗脱样品的安全性，试验用乙醇作为解吸剂，称取0.5 g预处理好的60～80目聚酰胺树脂，湿法装入内径为1.0 cm的色谱柱中，径高比为1∶10；室温下采用恒流泵，对浓度为6.0 mg/mL人参根总黄酮粗提物溶液进行上柱吸附，流速为1.5 mL/min，饱和吸附后，再分别用不同浓度的乙醇水溶液(20%～100%)和不同流速(1.0、1.5、2.0和2.5 mL/min)进行洗脱.计算解吸附率.

1.5.4 聚酰胺树脂精制级数的优化

按优化的富集工艺，取预处理好的60～80目聚酰胺树脂，湿法装入内径为1.0 cm的色谱柱中使柱高为10 cm，室温下采用恒流泵，对人参根总黄酮粗提液浓度为6.0 mg/mL、pH10的人参根黄酮提取物进行上柱吸附，吸附流速为1.5 mL/min，饱和后，用80%乙醇以1.5 mL/min的速度进行3次洗脱，绘制洗脱曲线并计算不同洗脱级别下人参根黄酮的纯度.

2 结果与分析

2.1 聚酰胺树脂型号的选择

经分光光度法测定，粗提物中人参根总黄酮浓度为0.48 mg/mL.由于不同聚酰胺树脂对黄酮吸附能力的强弱不同，解吸难易程度也不同.因此，筛选出吸附率和解吸率都高的树脂，才能保证有效成分被最大限度地回收.以提取的人参黄酮粗提物为原料，采用不同目数的聚酰胺树脂进行分离.表1表明两种树脂的吸附和解吸能力差别较大，60～80目树脂比30～60目的树脂比表面积大，故其吸比附量较大，吸附率可达到83.85%.同时，60～80目聚酰胺树脂的解吸附能力也较高，因此本实验选用60～80目的聚酰胺树脂.

表1 不同目数聚酰胺吸附与解吸附结果(n=3)

2.2 不同温度及pH下静态吸附与解吸附特性

表2为不同温度对聚酰胺树脂静态吸附性能的影响结果，温度对聚酰胺树脂的静态吸附性能有一定影响，但不同温度下的溶液的吸附率差别不大，所以采用室温作为聚酰胺树脂吸附时的环境温度.

表2 温度对聚酰胺树脂静态吸附性能的影响(n=3)

表3 为不同pH条件下，聚酰胺树脂静态吸附结果.从表3可以看出，随着pH值的增加，吸附率先逐渐增加，但当pH值达到11.0时，吸附率开始降低.黄酮类化合物含有酚羟基，多呈酸性，故在碱性环境中溶解性较高，利于聚酰胺树脂的吸附，但是碱性过强时容易破坏黄酮化合物的母核，所以选择介质的pH值在10.0条件下吸附人参根黄酮.

表3 pH值对聚酰胺树脂静态吸附性能的影响

2.3 聚酰胺树脂动态吸附与解吸附特性

2.3.1 上样液浓度对动态吸附的影响

表4 液浓度对聚酰胺树脂动态吸附性能的影响

黄酮粗提物中富含多种糖类等杂质，其溶液的浓度是影响聚酰胺树脂吸附性能的重要因素之一.聚酰胺树脂对黄酮的吸附容量一般以较低质量浓度进行较为有利.如果黄酮粗提物质量浓度过高，其它杂质影响树脂的吸附量，使树脂的处理量变小，树脂使用周期也将缩短；黄酮粗提物质量浓度过低，吸附效率降低.表4为不同上样液浓度树脂对人参根黄酮吸附结果，人参根总黄酮粗提物溶液的质量浓度为2.0、4.0、6.0 mg/mL时，吸附量较适宜，还观察到，人参根总黄酮粗提物溶液的质量浓度为6.0 mg/mL时，吸附过程的稳定性好，且吸附时间也较适宜.因此，选择质量浓度为6.0 mg/mL人参根总黄酮粗提物溶液作为料液.

2.3.2 上样液流速对动态吸附的影响

见表5为体积流量在1～2.5 mL/min时吸附量和吸附率结果，吸附量随体积流量的增大而下降，体积流量过大，树脂的吸附量下降，提早泄露，并且试验中可观察到人参根黄酮粗提物在树脂上的分布未呈明显的梯度变化，即吸附过程的稳定性差；体积流量过小，树脂的吸附量过大，吸附时间延长，生产效率低.考虑工作效率和吸附效果，选择吸附体积流量1.5 mL/min较适当.

表5 流量对聚酰胺树脂动态吸附性能的影响

2.3.3 乙醇浓度对解吸率及黄酮纯度的影响

考虑到所洗脱样品的安全性，试验用乙醇作为解吸剂，分别用50 mL 20%、40%、60%、80%、100%乙醇水溶液进行洗脱，结果如表6，从表中可知，随着乙醇浓度增大，解吸率逐渐增大，但是样品纯度却是先增加后减小，80%乙醇洗脱时纯度最大，综合考虑，选择80%乙醇作为洗脱剂进行后续试验.

表6 洗脱剂浓度对聚酰胺树脂的动态解吸的影响

2.3.4 解吸液流速对解吸率的影响

表7为优化条件下，人参根黄酮经饱和吸附后，用80%乙醇水溶液以流速分别为1.0、1.5、2.0和2.5 mL/min进行洗脱的结果.从表7中可知，随着洗脱剂流速增大，解吸率逐渐减小，但是解吸剂流速过小，解吸时间又会增加，所以综合考虑，选择解吸附流速为1.5 mL/min.

表7 洗脱剂流速对聚酰胺树脂动态吸附性能的影响

2.4 精制级数对人参根黄酮收率及纯度的影响

图1为优化的工艺条件下人参黄酮洗脱曲线.图1显示，60～80目聚酰胺树脂在优化的条件下，解吸时间都较短，约12 min达到峰值，60 min内基本解吸完全.因此，优化的工艺能高效率的富集人参根总黄酮.为了提高聚酰胺树脂的利用率和浓缩效果，人参根总黄酮洗脱液浓缩后再进行3次聚酰胺纯化试验，结果见表8，结果表明经聚酰胺树脂3次富集后，人参根总黄酮粗提液中黄酮含量从1.96%提高到48.38%.

图1 80%乙醇溶液动态洗脱曲线

精致级数黄酮纯度(%)粗品1.96一级32.06二级39.97三级48.38

3 结 论

采用聚酰胺树脂富集人参根总黄酮的最佳工艺

为：人参根总黄酮粗提液上样浓度为6 mg/mL，上柱流速为1.5 mL/min，而后用水洗至无色，再以80%乙醇洗脱，洗脱流速为1.5 mL/min.经3次上柱吸附纯化后，人参根黄酮化合物的纯度可从粗品的1.96%提高到达到48.38%.结果表明，聚酰胺树脂富集纯化人参根总黄酮方法可行.该研究为人参的综合利用提供理论依据.

参 考 文 献

[1] 黎 阳, 张铁军, 刘素香, 等. 人参化学成分和药理研究进展[J]. 中草药, 2009, 40(1): 164-166.

[2] Ali MB, Hahn EJ, Paek KY. Methyl Jasmonate and Salicylic Acid Induced Oxidative Stress and Accumulation of Phenolics in Panax Ginseng Bioreactor Root Suspension Cultures[J]. Molecules, 2007, 12(3): 607-621.

[3] 魏春雁, 徐崇范, 罗维莹, 等. 国产西洋参叶黄酮成分研究[J]. 吉林农业大学学报, 1999, 21(3): 7-11.

[4] 吴新荣, 刘志刚, 颜仁梁, 等. 聚酰胺颗粒分离纯化土茯苓总黄酮研究[J]. 中药材, 2009, 32(10): 1606-1609.

[5] 杨武英, 上官新晨, 徐明生, 等. 聚酰胺树脂精制青钱柳黄酮的研究[J]. 天然产物研究与开发, 2008, 20(2): 320-324.

[6] 张 蕾, 廖琼峰, 谢智勇, 等. 聚酰胺-大孔树脂联用富集苦参总黄酮[J]. 中草药, 2011, 42(10): 1968-1972.

[7] 张 儒, 张变玲, 赵 勇, 等. 人参根中黄酮类化合物提取及其抗氧化性研究[J]. 中成药, 2012, 34(10): 1896-1900.

[8] 杨必成, 刘 海, 杨义芳, 等. 聚酰胺树脂纯化油菜花粉黄酮部位工艺研究[J]. 中草药, 2011, 42(11): 2240-2243.

Study on Enriching Flavonoids from Roots of Panax Ginseng with Polyamide Resin

ZHANG Ru, ZHANG Bian-ling, XIE Tao, LI Gu-cai, HU Jian-chang, YI Tuo, CAI Jin-hong

(College of Chemistry and Chemical Engineering, Hunan Institute of Engineering, Xiangtan 411104, China)

To investigate the enrichment technology of flavonoids with polyamide resin from the roots of Panax ginseng, the optimal enrichment technique is confirmed by studying the static and dynamic absorption and desorption of flavonoids from the roots of P. ginseng with polyamide resin under various conditions. The optimized technique is verified and the high purification flavonoids are produced. The results show that the optimum experimental conditions are as follows: loading concentration of flavonoids is 6.0 mg/mL, pH10.0 and the most effective desorption is obtained with 80% of alcohol as eluent with a flowing rate of 1.5 mL/min. The maximum content of the enrichment flavonoid reaches to 48.38% whichis higher than 1.96% in the crude extraction solution. In conclusion, the process is feasible to enrich flavonoids from the roots of P. ginseng with polyamide resin.

roots of Panax ginseng C. A. Meyer; total flavonoids; polyamide resin; enrichment

2014-10-27

湖南省教育厅科研资助项目(11C0329)；国家大学生创新创业训练计划项目(201411342004)；湖南省大学生研究性学习和创新性实验计划项目(湘教通[2014]248号).

张 儒(1979-)，男，博士，讲师，研究方向：天然活性成分生物合成调控与开发利用.

张变玲(1982-)，女，硕士，讲师，研究方向：天然活性成分开发与利用.

R284.2

A

1671-119X(2015)01-0058-04