胃袖状切除附加空回肠吻合术对ZDF大鼠GLP-1蛋白表达的影响

周小钢，王恺京，徐安安，高 玮，陆佳军，朱江帆

(同济大学附属东方医院，上海，200120)

近年，减重手术作为治疗2 型糖尿病及相关代谢性疾病的重要手段，其作用效果已得到了众多临床资料与实验数据的证实［1-2］。术式主要有胃袖状切除(sleeve gastrectomy，SG)、胃旁路术及胃袖状切除附加转流术等。研究表明，胰高血糖素样肽-1(glucagonlike peptide 1，GLP-1)分泌水平变化可能是减重手术治疗2 型糖尿病的主要机理［3］。GLP-1 主要是由末端回肠L 细胞分泌，GLP-1 分泌的增强主要由于食物较早地刺激末端回肠L 细胞引起，可有效降低血糖［4-6］。我们之前的研究发现SG 组与胃袖状切除附加空回肠吻合(sleeve gastrectomy plus side-to-side jejunoileal anastomosis，JI-SG)组术后血清GLP-1 水平明显升高［7］，然而L 细胞组织学是否发生了改变，对此我们不得而知。基于此，我们在SG 的基础上附加空回肠吻合术，从而使得食物提早刺激末端回肠，观察末端回肠黏膜组织L 细胞组织学改变及相应血液激素水平的改变，从而探讨GLP-1 分泌水平改变的原因，并进一步检验GLP-1 在减重手术中的作用，进而优化减重手术方式。

1 资料与方法

1.1 实验动物准备与分组 雄性10 周龄糖尿病肥胖(Zucker diabetic fatty，ZDF)大鼠30 只(购于北京维通利华实验动物技术有限公司)，饲养于同济大学动物实验中心无特定病原体(specific pathogen free，SPF)环境中，将大鼠按随机数字表法分为假手术(sham surgery，SS)组、SG 组与JI-SG组。JI-SG 组行胃袖状切除附加空回肠侧侧吻合术，SG 组行袖状胃切除术，SS 组行假手术。

1.2 实验动物手术干预 SG 组手术方法［8］:沿胃部大弯侧纵行切除整个胃底及约3/4 胃体，缝合胃切缘止血后将胃置于原位;JI-SG 组手术方法:上述胃袖状切除后距Treitz 韧带及回盲瓣各20 cm 游离出空肠、回肠并行侧侧吻合术;SS 组手术方法:大鼠开腹后即关闭。各实验组关腹前均腹腔注射1 ml 庆大霉素，三组实验时间大致相等，以消除手术应激对结果的影响。

1.3 标本的制备 血清学标本:术前2 d 及术后规律两周一次取眶静脉血约0.5 ml，离心后取上清液置于-20 摄氏度冰箱保存;组织学标本:于术后第12 周处死大鼠，并取距回盲瓣5 cm 末端回肠组织，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，切片机制备石蜡切片。

1.4 检测项目及方法

1.4.1 血糖 术前2 d 及术后两周一次眶静脉采血，使用罗氏血糖仪检测其血糖水平。

1.4.2 末端回肠黏膜GLP-1 水平测定 采用免疫组化SP法，常规脱蜡水化后抗原修复;放入3%过氧化氢溶液，孵育25 min;滴加Ⅰ抗(购自美国Abcam 公司)，稀释比例为1∶100;滴加Ⅱ抗，室温孵育50 min;DAB 显色，阳性为棕黄色，苏木素复染，中性树胶封片。显微镜下玻片组织充满视野拍照，应用Image-Pro Plus 6.0 软件选取相同的棕黄色作为判断所有照片阳性的统一标准，对每张照片进行分析得出每张照片阳性的累积光密度值(integral optical density，IOD)，保存图片中组织的面积(AREA)，IOD/AREA 计算出平均光密度值(Mean Density)。

1.4.3 血清胰岛素、GLP-1 水平测定 采用ELISA 法检测大鼠血清胰岛素及GLP-1 水平，操作步骤严格按照试剂盒说明书(购自美国R＆D 公司)进行。

1.5 统计学处理 采用SPSS 17.0 软件进行统计学分析，量化数据用(均数±标准差)表示，所获数据呈正态分布，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两显著性检测采用LSD-t 检验;P ＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 存活率 SS 组大鼠均存活，存活率100%;SG组大鼠死亡1 只，术后第2 天吻合口漏腹腔感染死亡，存活率为90%;JI-SG 组死亡3 只，其中2 只术后第10 天吻合口粘连狭窄引起梗阻而死亡，另1 只于术后第20 天极度消瘦死亡。3 组总的存活率为86.7%。

2.2 回肠末端黏膜组织学检测 GLP-1 的产生部位主要位于大鼠回肠末端黏膜组织L 细胞，细胞数量较多，胞质深染。阳性强度分为4 级:染色无色计为0，淡黄色为1，棕黄色2，棕褐色为3。平均光密度值评估GLP-1 在回肠末端黏膜组织表达水平，SS组、SG 组及JI-SG 组分别为:0.008492 ±0.0019246，0.009091 ±0.0021523，0.011408 ±0.0027251。JISG 组平均光密度明显高于SS 组及SG 组(P ＜0.05)，局部可见L 细胞增生。SG 组平均光密度值高于SS 组。见图1、图2、表1。

2.3 血清GLP-1 水平改变 术前各组血清GLP-1水平差异无统计学意义(P ＞0.05)，术后SS 组与术前水平差异无统计学意义(P ＞0.05)。SG 组术后GLP-1 水 平 缓 慢 上 升，至 12 周 达(1. 79 ±0.12)pmol/L，高于SS 组(P ＜0.05)。术后2 周JISG 组由术前(1.69 ±0.1)pmol/L 上升至(1.92 ±0.12)pmol/L，随后缓慢上升，至12 周达(1.97 ±0.11)pmol/L，术后各时间点与术前相比差异均有统计学意义(P ＜0.05)，术后同时间点与其他两组的差异也具有统计学意义(P ＜0.05)。见表2。

2.4 血糖水平改变 术前各组血糖水平差异无统计学意义(P ＞0.05)，术后2 周SG 及JI-SG 组血糖即有明显下降，术后2 周SG 组血糖水平由术前(11.4 ±3.1)mmol/L 降至(6.9 ±1.6)mmol/L，随后逐渐恢复上升，并超过术前水平，至12 周升至(13.4 ±2.8)mmol/L，但同时间点低于SS 组，差异有统计学意义(P ＜0.05)。术后2 周JI-SG 组血糖水平由 术前(12. 4 ± 1. 5)mmol/L 降至(6. 3 ±0.7)mmol/L，随后长时间保持稳定水平，至12 周达到(5.1 ±0.9)mmol/L，同时间点明显低于SS 组及SG 组(P ＜0.05)。见表3。

2.5 血清胰岛素水平的改变 术前各组胰岛素水平差异无统计学意义(P ＞0.05)，SS 组胰岛素水平呈现缓慢上升，至12 周达(7.51 ±1.6)mU/L。术后2 周，SG 组、JI-SG 组 分 别 由 术 前(5. 13 ±1.2)mU/L、(5. 24 ± 1. 1)mU/L 升 至(6. 53 ±1.4)mU/L、(6.57 ±1.3)mU/L ，呈现与SS 组相同趋势。随后缓慢下降，术后12 周SG 组达到(5.21±1.4)mU/L水平，与术前相比差异无统计学意义(P ＞0.05);JI-SG 组达到(4.53 ±1.3)mU/L，明显低于术前及其他两组水平(P ＜0.05)。见表4。

图1 各组末端回肠粘膜组织GLP-1 蛋白表达(1-HE ×200;2-HE ×400)a:SS 组GLP-1 蛋白，胞质淡染;b:SG 组GLP-1 蛋白，胞质染色偏黄色;JI-SG 组GLP-1 蛋白，胞质深染，为棕黄色，细胞数量明显增加。

图2 各组GLP-1 在末端回肠黏膜组织表达比较

表1 末端回肠黏膜组织GLP-1 表达光密度值的比较(±s)

表1 末端回肠黏膜组织GLP-1 表达光密度值的比较(±s)

* P ＜0.05 vs.SS 组，ΔP ＜0.05 vs.SG 组

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表2 各组手术前后血清GLP-1 水平的比较［(±s)，ρ/pmol·L-1］

表2 各组手术前后血清GLP-1 水平的比较［(±s)，ρ/pmol·L-1］

* P ＜005 vs.术前;ΔP ＜0.05 vs.SS 组;#P ＜0.05 vs.SG 组

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表3 各组手术前后血糖水平的比较［(±s)，ρ/pmol·L-1］

表3 各组手术前后血糖水平的比较［(±s)，ρ/pmol·L-1］

* P ＜005 vs.术前;ΔP ＜0.05 vs.SS 组;#P ＜0.05 vs.SG 组

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表4 各组手术前后胰岛素水平的比较［(±s)，ρ/mU·L-1］

表4 各组手术前后胰岛素水平的比较［(±s)，ρ/mU·L-1］

* P ＜005 vs.术前;ΔP ＜0.05 vs.SS 组;#P ＜0.05 vs.SG 组

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3 讨 论

SG 是近年备受关注的减重术式之一，具有手术操作简单、安全、有效、并发症发生率低等优点［9-12］，然而一些资料也表明了SG 疗效不如转流术、长期疗效不明确、术后容易反弹等缺点［13-14］。Melissas等［15］将JI-SG 与单纯SG 进行了对比分析，发现JISG 在改善2 型糖尿病方面明显优于SG;同时也发现JI-SG 术后食物自十二指肠到达盲肠时间为11 min，而SG 术后需要31 min;JI-SG 术后未出现死亡或重大手术并发症。JI-SG 操作简单、不改变肠道结构的连续性，因此认为JI-SG 是简单、安全、有效的减重术式;同时空回肠吻合术可在单纯SG 失败或术后出现反弹的情况下再行实施。本实验采用ZDF 大鼠制作JI-SG 模型，观察术后降糖作用及相应激素水平的改变，以探讨可能机制。

通过观察比较我们发现，JI-SG 组GLP-1 水平的血清学检测水平明显高于SG 组与SS 组，组织学检测发现JI-SG 组蛋白表达水平显著增加，染色为棕黄色，同时伴有L 细胞的增生。在血糖控制、胰岛素水平方面，JI-SG 均体现出优势，JI-SG 术后血糖保持稳定的低水平，而SG 组血糖在术后第二周达到最低值后缓慢回升，表明SG 具有降糖的疗效，同时也存在血糖反弹的现象，这与Himpens 等［16］的研究结果一致。然而是什么原因导致了JI-SG 在治疗2型糖尿病方面的显著疗效?食物较早刺激末端回肠可显著增强GLP-1 的分泌，而GLP-1 水平升高是导致血糖下降的关键因素。GLP-1 主要由末端回肠L细胞分泌产生，GLP-1 可促进糖原合成、增加胰岛素基因表达、胰岛素的分泌、抑制胰高血糖素分泌、促进β 细胞增生并抑制其凋亡［17-20］;目前GLP-1 降糖疗效已得到证实，相关药物已应用于临床［21］。本实验中血清GLP-1 水平在第2 周即有明显上升，之后保持稳定水平，第12 周组织学检测发现L 细胞分泌GLP-1 功能增强同时伴有显著增生，我们认为L 细胞在发生组织学改变前即有分泌功能增强现象，长期的代偿作用导致细胞的增生，这种组织学改变可能是机体长期维持GLP-1 高水平的重要原因。

SG 组大鼠的胃肠道生理结构并未改变，但其组血浆GLP-1 水平及蛋白表达水平均有提高，现有资料表明［22-24］，SG 手术切除胃底、大部分胃体，导致体内Ghrelin 激素水平降低，而Ghrelin 可抑制胰岛素的分泌及外周组织利用葡萄糖，同时Ghrelin 可促进胃排空，使得食物较早刺激回肠产生较多GLP-1，因此Ghrelin 激素水平的降低可能是SG 对2 型糖尿病有治疗效果的原因之一。朱江帆等［25］则提出“胃中心学说”，认为减重手术关键环节在胃大弯，现有主流减重手术均减少了食物对胃的刺激。很有可能导致某种特殊因子分泌减少，从而缓解胰岛素抵抗，交感神经张力降低，导致糖尿病、高血压、多囊卵巢综合征等代谢性疾病得到缓解，因此更多的胃肠道未知激素尚待研究。

本实验证实了JI-SG 治疗ZDF 大鼠2 型糖尿病的持续有效性，其主要作用机制可能与末端回肠L细胞增生及其分泌GLP-1 增强有关。JI-SG 使部分未消化食糜较早进入末端回肠，起到吸收不良的作用，同时未完全消化食糜较早刺激末端回肠L 细胞，促进其分泌GLP-1 激素。空回肠侧侧吻合术使包括旷置肠段在内的肠攀均有食物通过，可避免因肠襻旷置导致的菌群改变、胆汁酸代谢改变、旷置肠襻细胞萎缩等问题。“尽量减少胃肠道结构破坏同时获得最佳减重及改善代谢效果”是减重手术改进的努力方向，此术式为术式改进提供了一个方案，其疗效尚待临床长期的随访研究。

［1］Pories WJ.Diabetes:the evolution of a new paradigm［J］.Ann Surg，2004，239(1):12-13.

［2］Kopelman PG.Obesity as a medical problem［J］.Nature，2000，404(6778):635-643.

［3］Tammy L，Kindel Stephanie M，Yoder Randy J，et al.Duodenal-jejunal exclusion improves glucose tolerance in the diabetic，Goto-Kakizaki rat by a GLP-1 receptor-mediated mechanism［J］.J Gastrointest Surg，2009，13(10):1762-1772.

［4］Wang TT，Hu SY，Gao HD，et al.Ileal transposition controls diabetes as well as modified duodenal jejunal bypass with better lipid lowering in a nonobese rat model of type II diabetes by increasing GLP-1［J］.Ann Surg，2008，247(6):968-975.

［5］Patriti A，Facchiano E，Annetti C，et al.Early improvement of glucose tolerance after ileal transposition in a non-obese type 2 diabetes rat model［J］.Obes Surg，2005，15(9):1258-1264.

［6］De Paula AL，Stival AR，Macedo A，et al.Prospective randomized controlled trial comparing 2 versions of laparoscopic ileal interposition associated with sleeve gastrectomy for patients with type 2 diabetes with BMI 21-34 kg/m2［J］. Surg Obes Relat Dis，2010，6(3):296-304.

［7］王恺京，徐安安，周小钢，等.袖状胃切除术附加空回肠侧侧吻合术减重与代谢改善作用［J］.中华消化外科杂志，已接受.

［8］王恺京，徐安安，周小钢，等.ZDF 大鼠胃袖状切除附加空回肠侧侧吻合术动物模型的建立［J］.腹腔镜外科杂志，2015，20(1):1-4.

［9］Melissas J，Koukouraki S，Askoxylakis J，et al.Sleeve gastrectomy-a restrictive procedure?［J］.Obes Surg，2007，17(1):57-62.

［10］Aggarwal S，Kini SU，Herron DM.Laparoscopic sleeve gastrectomy for morbid obesity:a review［J］.Surg Obes Relat Dis，2007，3(2):189-194.

［11］Cottam D，Qureshi FG，Mattar SG，et al.Laparoscopic sleeve gastrectomy as an initial weight-loss procedure for high—risk patients with morbid obesity［J］.Surg Endosc，2006，20(6):859-863.

［12］Kodama Y，Zhao CM，Kulseng B，et al.Eating behavior in rats subjected to vagotomy，sleeve gastrectomy，and duodenal switch［J］.Gastrointest Surg，2010，14(10):1502-1510.

［13］Rice RD，Simon TE，Seery JM，et al. Laparoscopic sleeve gastrectomy:outcomes at a military training center［J］. Am Surg，2010，76(8):835-840.

［14］Langer FB，Bohdjalian A，Shakeri-Leidenmiihler S，et al.Conversion from sleeve gastrectomy to Roux-en-Y gastric bypass-indications and outcome［J］.Obes Surg，2010，20(7):835-840.

［15］Melissas J，Peppe A，Askoxilakis J，et al.Sleeve gastrectomy plus side-to-side jejunoileal anastomosis for the treatment of morbid obesity and metabolic diseases:a promising operation［J］.Obes Surg，2012，22(7):1104-1109.

［16］Himpens J，Dobbeleir J，Peeters G. Long-term results of laparoscopic sleeve gastrectomy for obesity［J］. Ann Surg，2010，252(2):319-324.

［17］Mingrone G，Castagneto-Gissey L.Mechanisms of early improvement/resolution of type 2 diabetes after bariatric surgery［J］.Diabetes Metab，2009，35(6):518-523.

［18］Buchwald H，Avidor Y，Braunwald E，et al. Bariatric surgery:a systematic review and meta-analysis［J］. JAMA，2004，292(14):1724-1737.

［19］MaeDonald PE，EI-Koly W，Riedel MJ，et al.The multiple actions of GLP-1 on the process of glucose-stimulated insulin secretion［J］.Diabetes，2002，51 Suppl 3:S434-S442.

［20］de Gordejuela AG，Pujol Gebelli J，García NV，et al.Is sleeve gastrectomy as effective as gastric bypass for remission of type 2 diabetes in morbidly obese patients?［J］.Surg Obes Relat Dis，2011，7(4):506-509.

［21］Jørgensen NB，Dirksen C，Bojsen-Møller KN，et al.Exaggerated glucagon-like peptide 1 response is important for improved βcell function and glucose tolerance after Roux-en-Y gastric bypass in patients with type 2 diabetes［J］.Diabetes，2013，62(9):3044-3052.

［22］Tharakan G，Tan T，Bloom S. Emerging therapies in the treatment of‘diabesity’:beyond GLP-1［J］. Trents Phamacol Sci，2011，32(1):8-15.

［23］Murata M，Okimura Y，lida K，et al.Ghrelin modulates the downstream molecules of insulin signaling in hepatoma cells［J］.J Biol Chem，2002，277(7):5667-5674.

［24］Broglio F，Gottero C，Benso A，et al.Effects of ghrelin on the insulin and glycemic responses to glucose，arginine，or free fatty acids load in humans［J］.J Clin Endocrinol Metab，2003，88(9):4268-4272.

［25］朱江帆，周小钢.腹腔镜胃袖状切除术临床应用价值［J］.中国实用外科杂志，2014，34(11):1032-1035.