巨尾桉叶中原花色素提取工艺比较及不同溶剂萃取物生物活性的研究

姜 萍， 刘 鑫， 萧 伟， 丁 岗， 赵林果

(1.南京林业大学 化学工程学院，江苏 南京 210037； 2.江苏康缘药业股份有限公司，江苏 连云港 222001)

·研究报告——生物质活性成分·

巨尾桉叶中原花色素提取工艺比较及不同溶剂萃取物生物活性的研究

(1.南京林业大学 化学工程学院，江苏 南京 210037； 2.江苏康缘药业股份有限公司，江苏 连云港 222001)

通过正交试验探讨了巨尾桉叶中原花色素的3种提取方法的最佳提取工艺条件，并进行了对比。结果显示，传统溶剂提取法的最优工艺为：60%乙醇、80 ℃、100 min、料液比1 ∶14(g ∶mL，下同)，原花色素得率5.95%；微波辅助提取法的最优工艺为:50%乙醇、微波功率200 W、微波时间4 min、料液比为1:20，得率5.48%；超声波辅助提取法的最优工艺为：60%乙醇、60 ℃、超声波时间25 min、料液比为1 ∶14，得率为6.07%。超声波辅助提取法效果最好，时间短，得率高。实验对超声波提取物的不同溶剂萃取物体外抗氧化性和抗肿瘤活性进行了研究，结果表明，乙酸乙酯萃取物抗氧化作用较强，当质量浓度为1.2 g/L时，对DPPH自由基清除率达到96.33%；乙酸乙酯萃取物质量浓度为2 g/L时，对于人肝癌细胞Bel-7404具有很强的抗肿瘤活性,抑制率为56.37%。

巨尾桉；原花色素；提取工艺；抗氧化和抗肿瘤

桉树是桃金娘科桉属植物的统称，天然分布于澳大利亚大陆及华莱士线以东岛屿等地区。桉树植物主要有巨尾桉、蓝桉和柠檬桉等。目前对桉叶油的化学成分、药理作用及其机理做了多方面的分析和研究[1-4]。研究发现巨尾桉叶是一种富含原花色素的植物资源。原花色素具有抗氧化、抗菌、抗病毒、预防或抑制肿瘤、预防或治疗冠心病和中风等心脑血管疾病的作用，广泛应用于医药、食品、化妆品、日用化学品以及保健品等方面，具有广阔的应用前景[5-6]。原花色素的提取一般采用传统的有机溶剂和水提取法。微波辅助提取法以及超声波辅助提取法用于巨尾桉中原花色素的提取的研究报道很少[7-9]。本研究针对巨尾桉叶中原花色素的不同提取方法的工艺进行了优化，同时对巨尾桉叶中超声波辅助提取的不同溶剂萃取物的体外抗氧化活性和抗肿瘤活性进行了初步研究，旨在能开发出一种天然的抗氧化剂和抗肿瘤药剂，为巨尾桉叶的综合利用开辟一条新的途径。

1 实 验

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料 新鲜巨尾桉叶，采自广西南宁七坡林场，原料风干，粉碎粒度为0.63 mm。4-(二甲胺基)肉桂醛，Sigma-Aldrich公司；原花青素A2，Chroma公司。其它提取溶剂和分析试剂均为国产分析纯。

1.1.2 仪器 UV-2450紫外可见分光光度仪，日本SHIMADZU公司；KH-800KDB型高功率数控超声波仪，昆山禾创超声仪器有限公司；MAS-I型常压微波辅助合成/萃取反应仪，新仪微波化学科技有限公司；Spectra Max Plus 微盘读数器，分子仪器公司。

1.2 实验方法

1.2.1 传统溶剂浸提法 准确称取已粉碎的巨尾桉叶原料5.00 g，装入250 mL圆底烧瓶中，加入不同体积分数的乙醇溶剂，在不同的提取温度、提取时间、料液比(g ∶mL，下同)、提取1次的条件下，进行热浸提、过滤、定容至250 mL。用于测定原花色素的含量，并计算得率。

1.2.2 微波辅助提取法 准确称取已粉碎的原料5.00 g，装入250 mL长颈圆底烧瓶，加入不同体积分数的乙醇溶剂，在不同的微波辐射时间、料液比、微波功率、浸提1次的条件下，进行微波提取、过滤、定容至250 mL。用于测定原花色素含量。

1.2.3 超声波辅助提取法 准确称取已粉碎的原料5.00 g，装入250 mL圆底烧瓶中，加入不同体积分数的乙醇溶剂，超声功率200 W，在不同的提取温度、超声时间、料液比、浸提1次的条件下，进行超声波提取、过滤、定容至250 mL。用于测定原花色素含量。

1.3 总原花色素的含量分析方法

1.3.1 分析方法 4-(二甲胺基)肉桂醛(DMAC)与原花青素(PAC)的反应形成一个有颜色的物质，在640 nm处测吸光度，对PAC进行定量[10]。

1.3.2 0.1%DMAC溶液配制 用酸化乙醇溶解0.05 g DMAC，在50 mL容量瓶中进行定容。试剂稳定在-20 ℃至少9天。试剂是光敏感性的，用铝箔保护。

1.3.3 PAC标准溶液的制备 用甲醇稀释标准溶液至质量浓度为200、100、50、25、12.5、6.25和3.125 mg/L。

1.3.4 测试步骤 分别加63 μL的水空白样、各浓度的标准溶液和稀释样品于96孔板不同的孔中。所有样品都是一式3份。用多孔移液器吸取189 μL DMAC溶液加到每一个孔中，并混合。将盘放入Molecular Devices 仪器中，波长为640 nm，利用softmax pro软件程序测定其吸光值，根据标准曲线得出总原花色素的含量。按下式计算总原花色素得率。

R=CV/W×10-6×100%

式中:R—总原花色素得率，%;C—原花色素质量浓度，mg/L;V—待测提取溶液的总体积，mL;W—原料的质量，g。

1.4 不同溶剂萃取抗氧化活性试验

1.4.1 样品的制备 精确称取已粉碎的巨尾桉叶原料50.00 g于1 000 mL圆底烧瓶中，加600 mL 95%乙醇在60 ℃水浴中超声回流提取30 min，过滤，滤液真空浓缩除去乙醇，将浓缩后的溶液分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯进行萃取，萃取液经浓缩、冷冻干燥后得到石油醚、氯仿、乙酸乙酯和水的4种萃取物(已除去溶剂)。再分别配成质量浓度为0.24、0.48、0.72、0.96和1.20 g/L乙醇溶液，备用。

1.4.2 样品抗氧化活性的测定 分别精确量取不同质量浓度的各样品乙醇溶液各1.0 mL，置于10 mL离心管中，加入3.0 mL的0.08 mmol/L DPPH乙醇溶液，室温避光反应30 min，同时以同样方法处理的无水乙醇为空白，于517 nm波长处测定吸光值。按下列公式计算DPPH自由基清除率。

R=[A0-(AS-AC)]/A0×100%

式中:R—清除率，%;A0—1.0 mL无水乙醇+3.0 mL DPPH溶液的吸光度值;AS—1.0 mL样品溶液+3.0 mL DPPH溶液的吸光度值;AC—1.0 mL样品溶液+3.0 mL无水乙醇的吸光度值。

将实验重复3次，求得清除率的平均值。

1.5 不同溶剂萃取物抗肿瘤活性实验

1.5.1 样品的制备 取1.4.1节中的4种萃取物，以二甲基亚砜为溶剂，分别配制成质量浓度为200、20和2 g/L样品溶液。

1.5.2 抗肿瘤MTT方法实验 取指数生长期状态良好的细胞，加入0.25%胰蛋白酶消化液，消化使贴壁细胞脱落，计数2×104～4×104个/mL，制成细胞悬液。然后取细胞悬液接种于96孔板上，每孔180 μL，置恒温CO2培养箱中培养24 h。换液，加入受试药物，每孔20 μL，培养72 h。MTT试剂加入96孔板中，每孔20 μL，培养箱中反应 4 h。吸出上清液，加入DMSO，每孔150 μL，平板摇床上振摇5 min。用酶联免疫检测仪在波长为570 nm处测定每孔的吸光值，并通过下式计算细胞抑制率。

质量浓度分别为200、20和2 g/L，如果抑制率都大于50%，表示有很强的抗肿瘤活性。其中有2个浓度的样品抑制率大于50%，表示有较强的抗肿瘤活性。其中有1个浓度的样品抑制率大于50%，表示有较弱的抗肿瘤活性。其中3个浓度的样品抑制率都小于50%，表示没有抗肿瘤活性。

2 结果与讨论

2.1 不同提取方法条件优化及比较

2.1.1 传统溶剂浸提法 根据预实验结果，选出乙醇体积分数(A)、提取时间(B)、料液比(C)、提取温度(D)做4因素3水平L9(34)的正交试验，以提取得到的巨尾桉叶中总原花色素含量为考察指标，确定提取优化工艺条件。结果见表1。

表1 传统溶剂浸损法正交试验结果Table 1 Result of orthogonal test for traditional solvent extraction

由表1可知，各因素对提取率影响的顺序为D>A>B>C，最好的试验方案为A1B1C2D3，即提取温度为80 ℃，60%乙醇为溶剂，提取时间为100 min，料液比为1 ∶14。在此优化条件下进行了验证实验，测得总原花色素得率为5.95%。

2.1.2 微波辅助提取法 根据预实验结果，确定了提取次数，选出乙醇体积分数(A)、微波功率(B)、微波提取时间(C)、料液比(D)做4因素3水平L9(34)的正交试验，以提取得到的巨尾桉叶中总原花色素含量为考察指标，确定提取优化工艺条件，结果见表2。

表2 微波辅助提取法正交试验结果Table 2 Results of orthogonal test for microwave-assisted extraction

由表2可知，各因素对提取率影响的顺序为A>D>B>C，最好的试验方案为A2B2C1D2，即50%乙醇为溶剂，微波功率200 W，微波提取时间为4 min，料液比为1 ∶20。在此优化条件下进行了验证实验，测得总原花色素得率为5.48%。

2.1.3 超声波辅助提取法 根据预实验结果，确定了提取次数，选取乙醇体积分数(A)、料液比(B)、超声时间(C)、超声温度(D)做4因素3水平L9(34)的正交试验，以提取得到的巨尾桉叶中总原花色素含量为考察指标，确定提取优化工艺条件，结果见表3。

表3 超声波辅助提取法正交试验结果Table 3 Results of orthogonal test for ultrasonic-assisted extraction

由表3可知，各因素对提取率影响的顺序为C>D>A>B，最好的试验方案为A2B2C2D1，即60%乙醇为溶剂，超声温度60 ℃，超声时间为25 min，料液比为1 ∶14。在此优化条件下进行了验证试验，测得总原花色素得率为6.09%。

2.1.4 3种提取方法比较 实验原料各5 g，分别采用溶剂浸提法、微波辅助提取法、超声波辅助提取法以优化后的最佳工艺条件提取巨尾桉叶中的总原花色素，并用分光光度法测定提取物中原花色素含量，结果见表4。采用3种不同的提取方法并在最佳的工艺条件下对巨尾桉叶中的原花色素类化合物进行提取，由表4可以看出，传统溶剂浸提法和微波辅助提取法对总原花色素提取率均小于超声波辅助提取法。微波和超声波辅助提取法相对于溶剂浸提法都有较大优势，微波辅助提取法具有提取时间短，高效、省时等优点。而超声波辅助提取法的得率高，可避免高温对提取活性成分的影响等优势。

表4 3种提取方法提取工艺的比较Table 4 Comparison of extraction technology of three extraction methods

2.2 不同溶剂萃取物的体外抗氧化活性

图1 巨尾桉叶中不同溶剂萃取物的体外抗氧化活性Fig.1 Antioxidant activity of different solvent extracts

运用超声波辅助提取法对巨尾桉叶进行提取，用于测定巨尾桉叶中不同溶剂萃取物的体外抗氧化活性，测定结果如图1所示。由图1可知，随着样品溶液浓度增加，对DPPH·清除率都逐渐增强；但石油醚萃取液对DPPH·清除率增加不明显；乙酸乙酯萃取液在质量浓度大于0.48 g/L时，对DPPH·清除率已超过90%以上；其次水萃取物质量浓度大于0.96 g/L时，对DPPH·清除率超过90%。在较低质量浓度范围内时，乙酸乙酯萃取液就有很大清除率，当质量浓度为1.2 g/L时，对DPPH·清除率达到最大值为96.33%。所以，巨尾桉叶中不同溶剂萃取物的体外抗氧化活性中，乙酸乙酯萃取液体外抗氧化活性最强。

2.3 不同溶剂萃取物的体外抗肿瘤活性

运用超声波辅助提取法对巨尾桉叶进行提取，然后用4种不同溶剂萃取得到萃取物，并对人肺腺癌细胞H460及人肝癌细胞Bel-7404进行体外抗肿瘤活性实验，并与紫杉醇标准样品抗肿瘤活性进行比较。结果如表5所示。

表5 抗肿瘤活性结果分析Table 5 Results of anti-tumor activity

注：“+++”表示强效indicate best effect，“++”表示中效indicate better effect，“+”表示弱效indicate weak effect

由表5可以看出：在2 g/L 的低质量浓度下，对人肝癌细胞Bel-7404 的抑制率可达到56.37%，说明其对于人肝癌细胞Bel-7404具有很强的抗肿瘤活性。其次氯仿萃取物对人肺腺癌细胞H460和人肝癌细胞Bel-7404也有较强的抗肿瘤活性。而水萃取物和石油醚萃取物对人肺腺癌细胞H460和人肝癌细胞Bel-7404的抗肿瘤活性较低。

3 结 论

3.1 对比研究了从巨尾桉叶中提取总原花色素类化合物的3种提取方法，并通过正交试验优化，得出3种不同提取方法的最佳工艺条件。传统溶剂提取法：以60%乙醇为溶剂，提取温度为80 ℃，提取时间为100 min，料液比为1 ∶14，巨尾桉叶的总原花色素得率为5.95%；微波辅助提取法：5 g原料以50%浓度的乙醇作为溶剂，微波功率200 W，微波时间为4 min，料液比为1 ∶20，得率5.48%；超声波辅助提取法：以60%乙醇为溶剂，超声温度60 ℃，超声时间为25 min，料液比为1 ∶14，得率为6.09%。将3种提取方法进行了比较，结果表明超声波辅助提取法效果最好。

3.2 巨尾桉叶不同溶剂萃取物对DPPH·都有一定清除效果，尤其乙酸乙酯萃取物体外抗氧化活性最强,质量浓度1.2 g/L时对DPPH·清除率达到96.33%。巨尾桉叶中的化学成分具有很强的抗氧化作用，是一种天然的抗氧化剂，为巨尾桉的综合利用开辟一条新的途径。并对其抗肿瘤活性进行了研究，结果发现乙酸乙酯萃取物对于人肝癌细胞Bel-7404具有很强的抗肿瘤活性，质量浓度为2 g/L，对人肺腺癌细胞H460的抑制率为49.46%，对人肝癌细胞Bel-7404的抑制率为56.37%。

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Extraction Technology of Proanthocyanidins from Urophylla Leaves and Biological Activities of Different Solvent Extracts

JIANG Ping1, LIU Xin1, XIAO Wei2, DING Gang2, ZHAO Lin-guo1

(1.College of Chemical Engineering,Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China;2.Jiangsu KangYuan Pharmaceutical Co.,Ltd., Lianyungang 222001, China)

The optimum extraction conditions of proanthocyanidins from urophylla leaves using three extraction methods were investigated by using orthogonal experiment.The extracted results were compared.Then,vitro antioxidant and anti-tumor activities of different solvent extracts from ultrasonic extracts were studied.The optimum crafts for traditional solvent extraction method were 60% ethanol,80 ℃,100 min,ratio of material-liquid 1 ∶14(g ∶mL,the same below),and the obtained yield of proanthocyanidin was 5.95%.The optimum crafts for microwave-assisted extraction were 50% ethanol,microwave power 200 W,4 min for each time,ratio of material-liquid 1 ∶20 with the yield of proanthocyanidin 5.48%.And the optimum crafts for ultrasonic extraction method were 60% ethanol,60 ℃,ultrasonic time 25 min,ratio of material-liquid 1 ∶14,and the yield of proanthocyanidin was 6.07%.Ultrasonic assisted extraction worked best,due to the short extract time and the high yield.The results of antioxidant test showed that the ethyl acetate extracts from ultrasonic extracts exhibited the highest antioxidant activity,as well as the maximum of DPPH radical scavenging ratio was 96.33% with the concentration of 1.2 g/L among different solvent extracts.Experimental results of antitumor activity of different solvent extracts showed that the ethyl acetate extract possessed highest antitumor activity for human hepatoma cell Bel-7404 with the concentration of 2 g/L,and the inhibition rate was 56.37%.

urophylla;proanthocyanidins;extraction technology;antioxidant and antitumor activity

10.3969/j.issn.1673-5854.2015.04.004

2015-04-15

广西林产化学与工程协同创新中心基金项目(2013A03)；江苏高校优势学科建设工程资助项目(无编号)

姜 萍(1969—)，女，黑龙江伊春人，副教授，硕士生导师，主要从事天然产物化学与应用；E-mail:pingjiang07@hotmail.com

*通讯作者：萧 伟，教授，博士生导师，主要从事中药新品种、新工艺和新剂型的开发与研究;E-mail:xw@kanion.com。

TQ35

A

1673-5854(2015)04-0019-06