乳酸链球菌素分离纯化研究进展

左爱辉 孙远功 刘鑫峰

（洛阳奇泓生物科技有限公司，河南洛阳 471041）

乳酸链球菌素分离纯化研究进展

左爱辉 孙远功 刘鑫峰

（洛阳奇泓生物科技有限公司，河南洛阳 471041）

当今市场上的乳酸链球菌素纯度较低，限制了其应用前景。Nisin作为新型的高效、无毒、安全的天然食品防腐剂，进入人体后分解为人体可吸收的氨基酸，且不影响肠道菌群的正常活动。此外，Nisin在医疗卫生领域也有很大的应用前景。通过对Nisin常用分离纯化技术优缺点的分析，并总结前人在Nisin分离纯化方面的研究，为后续研究者提供一些理论参考。

乳酸链球菌素；盐析法；层析技术；HPLC

乳酸链球菌素（NinhibiforySubstance，Nisin）也叫乳酸链球菌肽或尼生素，是从链球菌属的乳酸链球菌发酵产物中提取的一类多肽化合物。Nisin作为新型的高效、无毒、安全的天然食品防腐剂，进入人体后被机体蛋白酶消化分解为氨基酸，被机体吸收利用，并且不影响肠道内正常菌群的生命活动，是当今食品行业中保鲜防腐，延长货架期的绝对良品。除此之外，Nisin在医疗卫生领域也有很大的应用前景，高纯度的Nisin对治疗母牛乳腺炎有很好的疗效［1］。然而，当今市售的Nisin纯度较低，且含有较多的杂蛋白，进入机体后会引起一些不良反应，影响了其在医疗领域的应用和推广。因此，如何获取高纯度的Nisin是未来研究者应着重努力的重点。

本文就当前科研和生产领域主要用到的分离纯化技术做简要陈述，并对其在乳酸链球菌素提取领域的应用现状进行分析，以期为今后获取高纯度的Nisin提出一些理论参考。

1 Nisin分离纯化技术

1.1 常用分离方法

目前乳酸链球菌素的常用分离纯化方法主要有：有机溶剂法、盐析法、菌体吸附法、树脂吸附法、泡沫分离法等。

1.1.1 有机溶剂法。有机溶剂法也称为正丙醇法，其利用有机溶剂沉淀Nisin，利用KH2PO4等进行盐析，反复沉淀后溶解（主要溶剂为正丙醇）得到乳酸链球菌素的粗品。该方法的缺点是不能充分沉淀，而且有机溶剂残余对Nisin应用有很大影响。鲁吉珂等［2］在试验中以有机溶剂三氯甲烷和正丁醇配合使用的方法，从发酵浓缩液中提取出乳酸链球菌素，正丁醇和三氯甲烷体积比1:1组成的复合溶剂，提取效果优于单一的有机溶剂。

1.1.2 盐析法。蛋白质分子在低盐浓度下的溶解度随着盐溶液浓度升高而增加，称为盐溶；当盐浓度不断上升时，蛋白质的溶解度又因溶解度下降而先后析出，称为盐析。乳酸链球菌素采用盐析法提取的过程中，用硫酸铵沉淀得到Nisin粗品，回收率相对较高，且所得Nisin产品活性损失较少。该方法缺点也非常明显，在盐析过程中，发酵液中的其他蛋白类物质也随之沉淀，导致Nisin成品纯度偏低。同时废水中的硫酸铵对环境污染严重，增加环保压力。

1.1.3 菌体吸附法。菌体吸附法通过调节pH使乳酸链球菌选择性的吸附、释放乳酸链球菌素。叶嗣颖等［3］通过pH吸附法，利用乳酸链球菌亚种研究了NisinZ分子在不同pH环境下的吸附作用及其分离纯化效率，并采用SDS-PAGE和RP-HPLC进行纯度鉴定，证实用此技术分离NisinZ具有高效、高纯度、操作简便等良好特性，但此法也存在着损失率偏高的问题。

1.1.4 树脂吸附法。树脂吸附法原理是乳酸链球菌素在一定条件下可以与某些树脂发生特异性吸附，改变条件后吸附减弱，乳酸链球菌素可被洗脱下来。大孔吸附树脂是一类具有大孔结构的非离子型高分子化合物，具有吸附和筛选功能，且容易再生，在分离纯化蛋白质时具有条件温和、设备简单和操作方便的特点［4］。王晖等［5］采用大孔吸附树脂分离发酵液中的乳链菌肽，确定了两种树脂D3520、D4020对乳链菌肽静态、动态吸附及静态解吸的最优化操作条件。与其他分离纯化方法相比，用大孔树脂分离纯化的方法简便易行、分离纯度高、安全无毒害，是一种有效地分离手段。

1.1.5 泡沫分离法。泡沫分离法主要采用鼓泡塔间歇分离，然后用无机盐盐析、喷雾干燥，制成食品级乳酸链球菌素粉末。生产中采用泡沫分离法受多种因素的影响，包括溶液pH值、表面活性剂性质、泡沫的性质、排沫方式、搅拌等。

1.2 层析色谱技术

层析色谱技术根据分离物质和固定相间作用力的不同，可分为凝胶过滤层析、离子交换层析、反相层析、亲和层析、亲核膜分离技术、高效液相色谱法等诸多方法。

1.2.1 凝胶过滤层析。凝胶过滤层析根据被分离物质分子量差异而进行分离。当含有不同大小的混合物样品加入到凝胶色谱柱中，随着洗脱液的流动，分子质量最大的物质因不能进入凝胶网孔而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，分子量最小的物质因能进入凝胶网孔而受阻滞，流速缓慢，致使最后流出色谱柱，从而使混合物样品中不同分子量的物质得以分离。该方法设备要求简单，操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果，因此被生物化学、分子生物学、生物工程以及医药学等领域广泛应用［6］。吴红艳等［7］采用凝胶层析对乳酸菌粗提液进行分离、纯化，得到乳酸菌肽纯化样品，并对其含量、纯度及抑菌效果等指标进行了测定，得出纯化时间在14～18h所收集的样品含量最高、纯度最高、抑菌效果最好。从而获得了重要的乳酸菌肽研究资料，为今后更进一步的研究打下基础。

1.2.2 离子交换层析。离子交换层析以离子交换树脂作为固定相，选择合适的溶剂作为流动相，使不同溶质按照其离子交换亲和力的不同而得到分离的方法。Nisin由34个氨基酸组成，同时具有疏水性和亲水性结构，其在不同的pH溶液中带有不同的电荷，因此可以通过离子交换层析法进行分离纯化。

1.2.3 反相层析。反相层析是利用非极性的反相介质为固定相，极性有机溶剂的水溶液为流动相，根据溶质极性（疏水性）的差别进行溶质分离纯化的层析方法。其固定相表面完全被非极性集团所覆盖，表现出强烈的疏水性。反相层析介质性能稳定，分离效率高，主要应用于分子量5000以下的小分子物质分析。

1.2.4 亲和层析。亲和层析是利用偶联亲和配基的亲和吸附介质为固定相来吸附目标产物，使其得到分离纯化的液相层析法。亲和层析法只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，达到千倍以上的纯化效果并保持较高的生物学活性。亲和层析法步骤简单，纯化时间短，非常有利于不稳定蛋白的纯化。目前亲和层析技术被广泛地应用于蛋白质的研究和制备领域，是分离纯化以及分析生物大分子（尤其是蛋白质）的有力工具［8］。

1.2.5 亲和膜分离。亲和膜分离是将亲和分离技术和膜分离技术结合，将亲和配基结合在分离膜上，利用膜作为基质，对膜进行改性，再按照吸附、清洗、洗脱和再生的过程，对生物产品进行分离纯化。亲和膜分离具有亲和分离技术的高选择性，同时亲和配基固定在膜载体上，传质阻力大大减小，便于连续、自动化操作，适用于工业化生产。在上述亲和层析介质制备的基础上，采用相同的亲和配基，选择合适的亲和膜载体，对载体活化及膜分离过程进行优化和放大，从而建立工业化规模层析装置。

1.2.6 高效液相色谱法。

高效液相色谱法（High PerformanceLiquidChromatography，简称HPLC）是一种高效快速分离化合物的方法，由于其灵敏度高，重复性好，分析速度快，应用范围广等特点，近年来在生物大分子的分离和纯化方面占据了极其重要的地位。此外高效液相色谱还具有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等优点。它能有效地分离各种多肽混合物，特别适用于分子质量不大的蛋白质及多肽物质的分离、纯化和鉴定，在蛋白质及多肽研究中得到了广泛的应用。其中反相高效液相色谱（RPLC）被广泛应用于分子质量不大的蛋白质分离、纯化和鉴定上［8］。

1.3 凝胶电泳

凝胶电泳主要包括SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和双向电泳。这两种研究方法主要应用于蛋白质分子量大小的定量研究。

1.3.1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳是由丙烯酰胺和交联剂N，N-亚甲基双丙烯酰胺在催化剂（过硫酸铵和四甲基乙二胺）作用下，聚合交联成网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。在聚丙烯酰胺凝胶中加入SDS后，其掩盖了蛋白质分子间电荷的差异，仅仅由蛋白质分子量大小决定其在凝胶中的迁移率。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）具有很高的灵敏度和准确性，是目前实验室检测蛋白质分离样品纯度常用的分析技术。

1.3.2 双向电泳。双向电泳技术是蛋白质组学研究的核心技术，主要由等电聚焦和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳复合而成，第一向进行等电点聚焦，蛋白质分子沿pH梯度进行分离，到达各自的等电点；随后，再沿垂直的方向进行分子量的分离。该技术能够把混合液中每个不同的蛋白质分子分离开来，由于操作复杂，价格昂贵，目前只适用于实验室研究。

2 层析技术和HPLC等在Nisin分离纯化中的运用

通常情况下，如果试验中需要相当纯度的抗菌肽，需要综合运用多种方法才能得到所需的产物。

李增利［9］研究认为，Nisin的电荷性和疏水性使其易从含有高浓度多肽的发酵液中分离出来。实验室纯化Nisin的程序一般包括硫酸铵盐析、离子交换色谱、疏水作用色谱和反相高效液相色谱多种纯化步骤；也可用等电聚焦电泳替代色谱分离法纯化Nisin，或采用免疫亲和色谱分离法一步纯化Nisin。尽管这些方法均具有很好的效果，但并不适合Nisin的大规模生产应用。

目前已经开发出一些基于吸附-解析或者相分配原理大规模回收和纯化Nisin的有效方法：如调节发酵液pH至6.0～6.5时，使Nisin吸附于产生菌细胞上，然后进行细胞分离，并在pH2.0和0.1mol/LNaCl条件下进行解吸而回收分离Nisin；不过当发酵液中Nisin浓度过高时，将会超过菌体细胞吸附Nisin的能力，影响Nisin的回收率。

杜琨等［10］采用分离、凝胶层析、抑菌实验、高效液相色谱法，来纯化从高原酸奶中提取的乳酸链球菌产生的乳酸链球菌素，得到了纯度较高的乳酸链球菌素。

盛博文［11］在研究中联合使用10k超滤管离心、SephadexG-25凝胶过滤、离子交换层析、制备型以及分析型反相高效液相色谱等方法，对乳酸链球菌发酵液进行分步分离和纯化，得到了纯品NisinP。其研究方法为生产Nisin提供很高的参考价值。

3 展望

随着人们生活水平的提高和绿色保健食品观念的增强，在食品中添加纯天然防腐剂的研究和应用越来越受到人们的重视和关注。Nisin作为一种高效、无毒的纯天然食品添加剂完全符合未来食品防腐剂的要求［12］。生产中如何获得高纯度的Nisin产品，使其在食品和医疗领域能够广泛应用，是我们研究者面临的主要难题。

层析技术和凝胶电泳作为现代分离技术的核心技术，在单一技术不能解决问题的情况下，如何通过两种功能互补的技术相结合而达到我们预期目的是我们亟待解决的问题。本文通过对Nisin分离纯化技术的总结，整理前人的研究成果，能够为后续研究者提供一些理论参考。

［1］吴俊强，曹立亭，胡松华.乳酸链球菌素治疗奶牛乳房炎效果观察［C］.兽医临床学术年会，2008：397-400.

［2］鲁吉珂，黎业娟，吴霄玥，等.有机溶剂沉淀法提取乳酸链球菌素的效果［J］.食品科学，2012，33（10）：84-86.

［3］叶嗣颖，谢昕，黄庆华，等.乳链菌肽NisinZ的pH吸附法分离纯化技术研究［J］.同济医科大学学报，2000，29（2）：124-126.

［4］赵利，钱芳，许建军，等.大孔吸附树脂及其在蛋白质、多肽和氨基酸分离纯化中的应用［J］.四川食品与发酵，2003，39（2）：39-41.

［5］王晖，胡滨，吴兆亮，等.大孔吸附树脂分离发酵液中乳链菌肽的工艺研究［J］.中国抗生素杂志，2007，32（9）：572-574.

［6］杨安钢，毛积芳，药立波，等.生物化学与分子生物学实验技术［M］.北京：高等教育出版社，2001：14-18.

［7］吴红艳，陈飞，桓明辉，等.乳酸菌肽分离纯化研究［J］.微生物学杂志，2006，26（2）：104-106.

［8］牛瑞，秦胜利.蛋白质分离纯化技术研究进展［J］.化工科技市场，2010，33（4）：16-18.

［9］李增利.Nisin的生产、提纯和检测［J］.中国食品添加剂，2004，4：64-68.

［10］杜琨，陈锦屏，苏凤贤，等.高原酸奶中乳酸链球菌产生的乳酸链球菌素纯化鉴定研究［J］.食品工业科技，2012，7：169-171.

［11］盛博文，杨海君，关向杰.乳酸链球菌抗菌肽的分离纯化及生物活性检测［J］.湖南农业科学，2010，11：17-19.

［12］李东，赵春燕.乳酸链球菌素的研究进展［J］.食品科技，2006，1：75-78.

The Research Progress of Separation and Purification of Nisin

Zuo Aihui Sun Yuangong Liu Xinfeng
(Luoyang ChiHon Biotechnology Co.，Ltd，Luoyang Henan，471041)

The low purity of Nisin on the present market limits its application prospects. Nisin, as a new highlyefficient, non-toxic, safe natural food preservative, decomposes into the amino acids that can be absorbed in humanbody, and does not affect the normal activities of the intestinal flora. In addition, Nisin also has great prospects in thehealth field. We provide some theoretical reference for subsequent researchers in the article through the analysis ofthe advantages and disadvantages of the commonly used separation and purification technology of Nisin andsummarizing previous studies on separation and purification of Nisin.

Nisin；salting out method；chromatographic technique；HPLC

Q936

：A

：1003-5168（2015）03-0134-3

2015-2-19

左爱辉（1986-），男，硕士研究生，研究方向：微生物工艺研究。