微型生物轮虫在水处理生物学实验教学中的应用

——以安徽工程大学为例

徐晓平1，陈延松2

(1.安徽工程大学 建筑工程学院，安徽 芜湖 241000；2.合肥师范学院 生命科学学院，安徽 合肥 230601)



微型生物轮虫在水处理生物学实验教学中的应用

——以安徽工程大学为例

徐晓平1，陈延松2

(1.安徽工程大学 建筑工程学院，安徽 芜湖 241000；2.合肥师范学院 生命科学学院，安徽 合肥 230601)

[摘要]水处理生物学是高等学校给排水科学与工程专业必修的专业基础课程，该课程传统实验教学中常包括大量的微生物培养和观察项目，实验操作难度相对较大。为了克服这个问题，我们选择使用具有易培养、繁殖快等特点，且在给水和排水处理系统中常见的一类微型水生生物轮虫作为水处理生物学实验课程的主要实验教学材料，并初步筛选了5个实验项目。实验教学表明微型水生生物轮虫在水处理生物学实验教学中具有重要的应用价值。

[关键词]轮虫；水处理生物学；实验教学

水处理生物学是高等学校给排水科学与工程专业的专业基础课之一，课程学习目的是让学生理解和掌握与水处理相关的微生物的基本概念、基本理论、实验方法以及在给水排水工程中的实际应用方面的知识，提升学生综合素质和创新能力，锻炼学生理论联系实际的能力，为今后从事城市给水排水工程、工业水处理工程、环境治理和管理等方面的工作奠定坚实的基础。实验教学是把理论的、抽象的知识具体化，实现对理论的深层次理解，培养学生的动手能力。因此，水处理生物学实验教学开展的好坏直接影响到这门课程的教学效果。由于给排水科学与工程专业学生普遍比较缺乏生物学知识，课程所涉及的生物种类多(有微生物、小型动物和大型植物)、范围广、形态多样，而且很多微型生物存在取材难、培养难、观察难等问题，所以，选择合适的微型生物种类作为教学材料关系到实验教学的效果。我们根据我院实验室的实际情况，选择微型生物——轮虫作为一种主要的一种教学材料，整合了实验教学内容，收到了较好的教学效果。

1轮虫及其在水处理过程中的出现情况

轮虫(rotifer)是体型最小的一类多细胞动物，其大小一般在100-1000μm之间，最小的仅有40um左右，最大的可达4mm。轮虫的体型多为纵长形，一般分为头、躯干和尾三部分。头部较宽，具有由1-2圈纤毛组成的头冠(corona)，头冠的形式不一，有些种类的头冠上半部完全裂开，形成2个纤毛轮器(trochus)，纤毛摆动时形似车轮，故称轮虫。轮虫广泛分布于各类水体中，是浮游动物四大类群之一。目前全世界已被描述的轮虫种类达2000种以上，我国已报道的轮虫亦已超过400种，在已报道的轮虫中，95%为淡水种类，其中75%的种类营附着生活且大多分布于沿岸带，真正营浮游生活的种类仅有100种左右。虽然轮虫的个体在所有后生动物中为最小，但其繁殖速率却是最快，因此它们能够迅速占领环境中的空生态位，并将初级生产量(藻类和细菌等)转化成次级消费者(昆虫、甲壳动物和鱼类幼体)可利用的形式，其转换效率极高，以至于总浮游生物现存量的30%由其产生。因此，轮虫在淡水水体生态系统结构功能、能量传递及物质转换上具有重要意义 。

1.1 轮虫在给水处理中的出现

给水系统中无脊椎动物的出现直接影响到出水水质，引起人们的高度关注。Schreiber等人[1]在颗粒活性炭(GAC)池中无脊椎动物的孳生研究中，指出滤池出水中无脊椎动物总丰度可高达6800个/m3，轮虫是炭池出水中占主导地位的无脊椎动物，占到了总数的97%。李小伟等[2]对南方某水厂炭池中无脊椎动物的种群进行了为期13个月的调查，研究发现，炭池中无脊椎动物共为3纲23种(类)，炭池滤后水中无脊椎动物密度最高可达825个/m3，主要为轮虫(58%-100%)，优势种类有单趾轮虫(36%)、鞍甲轮虫(26%)、狭甲轮虫(10%)、腔轮虫(7%)、蛭态目(5%)等。刘丽君等[3]在中试模拟炭柱上对生物活性炭(BAC)吸附池无脊椎动物的孳生繁殖以及群落变化规律进行了为期1年的研究，研究结果表明，性炭吸附柱中孳生的无脊椎动物中轮虫是占绝对优势的类群。尹文超等[4]添加一系列不同粒径和不同高度的砂垫层于5根活性炭滤柱中，在10个月的连续运行期间，滤柱出水中共检出7类无脊椎动物，其中轮虫为优势种群。

1.2轮虫在废水处理中的出现

轮虫在活性污泥废水处理系统正常运行时期、有机物含量较低以及出水水质良好时才会出现，故轮虫的存在说明处理效果较好。然而，有时处理系统因污泥龄较长、负荷较低，污泥因缺乏营养而老化解絮，这时轮虫可因污泥碎屑增多而大量繁殖，1毫升污泥混合液中可多至近万个轮虫，这是污泥老化解絮标志。污泥中常见的有玫瑰旋轮虫和猪吻轮虫，特别是后者的大量繁殖会将活性污泥蚕食光，造成污水处理失败，为避免此类现象发生，当镜检到猪吻轮虫有大量繁殖的趋势时，为了保持正常运行，可暂时停止曝气，制造厌氧环境抑制猪吻轮虫生长。此外，大多数轮虫以细菌、霉菌、藻类、原生动物及有机颗粒为食，因此，轮虫的出现对于活性污泥中微型生物种群之间关系的调节起到重要作用[5]。

2轮虫在水处理生物学教学中的使用

我们实验教学中所用的轮虫，包括萼花臂尾轮虫(Brachionuscalyciflorus)、旋轮虫(Philodinasp.)和猪吻轮虫(Dicraniphorussp.)等，均采自芜湖市汀棠湖(119°21'E, 31°20'N)，实验室内在25±1℃、自然光照条件下进行培养；所用轮虫培养液采用EPA配方[6]，所用饵料由HB-4培养基[7]培养的、处于指数增长期的斜生栅藻(Scenedesmusobliquus)，离心浓缩后使用。

我们所用教材是顾夏声主编的《水处理生物学》(第5版)，其中“第4篇-微生物学的研究方法”中涉及到可以使用轮虫以及斜生栅藻作为实验材料的实验教学环节有：显微镜使用及微生物形态的观察、微型动物的计数、培养基的制备和灭菌、藻类生长及其抑制实验、生物毒性检测等。下面分别作介绍：

2.1显微镜的使用和微生物形态的观察

该实验的目的是让学生掌握普通光学显微镜的使用方法，认识活性污泥中出现的原生动物和微型生物，并学习测量微生物大小的方法。我们的做法是：从单独培养和混合培养的轮虫的烧杯中分别吸取一滴滴到载玻片上，不盖盖玻片，让学生低倍镜下寻找水滴中的活动的轮虫，这一过程中让学生了解并掌握显微镜的使用方法。之后，盖上盖玻片，制备微生物标本玻片，在选定的接目镜下，利用低倍镜，确定目测微尺一格的长度(单位以微米计)，画出所见轮虫的草图，并量出其中一个轮虫的尺寸。记下观察所使用的接目镜和接物镜的放大倍数和算出显微镜的放大倍数。接下来改用高倍镜，更加清楚地观察轮虫形态和内部构造，画出形态草图，并与用低倍镜所看到的比较，记下显微镜的放大倍数。

2.2微型动物的计数

教材中设计的从活性污泥法曝气池混合液中取样计数，目的是让学生测定活性污泥法曝气池混合液中微型动物的数目，但实际操作过程中，可能受到污泥培养效果的好坏影响，导致样品中微型生物的较少，为了使学生更好地掌握计数方法，我们在取样活性污泥之前，先从轮虫培养液中定量抽样(根据实际可以选择用甲醛固定)，在微型动物计数板或者直接滴到载破片上进行全计数，进而根据抽样情况反推培养液中轮虫的实际密度，同样的方法还可以开展斜生栅藻的抽样计数。在掌握上述计数方法后，再让学生取活性污泥进行观察计数。

2.3培养基的制备和灭菌

该实验设计的目的是让学生学会玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备工作，掌握培养基配制和无菌水制备的方法。轮虫培养基我们使用的美国国家环保局的配方[6]，具体配方是：每升蒸馏水中96mg碳酸氢钠、60mg硫酸钙、60mg硫酸镁以及4mg氯化钾。培养斜生栅藻所用的培养基是HB-4培养基(章宗涉和黄祥飞, 1991)，具体配方是：每10L蒸馏水中2.0g硫酸铵、0.15g磷酸氢二钾，0.15g无水氯化钙，0.8g硫酸镁、1.0g碳酸氢钠、0.25g氯化钾、5ml土壤浸出液、10mlA5液、1.5ml三氯化铁(1.5%)溶液。这两种培养基均需高压灭菌后方可使用。此外，斜生栅藻在培养过程中，需要每天进行扩大接种，接种需在无菌环境中操作。因此，学生在完成上述操作过程中即可掌握电子天平的使用、无菌水的制备、灭菌以及无菌操作等技术。

2.4藻类生长及其抑制实验

实验目的是让学生掌握藻类的培养方法，学习藻类检测毒物的方法。我们采用投喂轮虫所用的斜生栅藻开展此项实验，藻种购置中国科学院水生生物研究所。斜生栅藻的培养采用半连续培养法，具体做法是：用无菌操作法从琼脂斜面上跳取适量健壮藻种，接种到盛有200mlHB-4培养基的500ml三角瓶中，置于恒温光照生化培养箱中培养。培养温度控制在25℃±1，光照4000-4500lx，每天光照时间为光/暗为16/8。自接种之日起，每天早中晚轻摇培养瓶3次。第2、3、4天分别加100mlHB-4培养基，第5天离心收集。离心条件是3500-4000转/分钟，离心结束后弃去上清液，应用细胞计数板抽样收集的藻细胞液在显微镜下计数，确定藻细胞浓度。

生长抑制试验我们采用硫酸铜作为毒物，逐级稀释成含Cu2+浓度为0.00001、0.0005、0.001、0.005、0.01mg/L和空白对照(即0mg/L)的测试液各200ml，吸取计数过的藻母液分别投入到上述测试液中，使起始藻细胞密度为0.1×106个/ml，之后放置培养箱中培养，培养过程与上述接种培养过程一致，第2、3、4、5每天从培养瓶中抽样1ml进行计数，每次一个瓶重复抽样3次，取平均值。最后根据记录数据计算藻的最大单位生长率，计算公式见顾夏声主编的《水处理生物学》P386页，并对硫酸铜的毒性进行评定。

2.5生物毒性检测

由于工业废水性质复杂，其中不少有毒物质很难用化学方法测得，且这些物质往往之间会发生复杂的相互作用，作用结果常很不易通过化学定量来表征，因此，需要开展生物毒性实验来检测废水综合毒性。我们教材中建议的实验材料是鱼类，但是鱼类存在难培养、敏感度不够以及成本大等特点。轮虫具有分布广泛、繁殖迅速、世代时间短、易培养以及存活、繁殖和行为等对环境理化因子的变化敏感等优点，因此在水生态毒理学研究和水环境监测中日益受到研究者的青睐[8]。美国国家环保局将萼花臂尾轮虫和褶皱臂尾轮虫(B.plicatilis)分别作为淡水和海水污染的测试生物列入了国家测试标准[9]。

我们开展此项实验的具体做法是：第一步，废水取样，取工业废水和污水处理厂不同工艺段的出水，进行常规理化分析后冷藏保存。第二步，实验前逐级稀释废

水样品，按照废水与轮虫培养液体积比逐级稀释，如100%、75%、50%、25%等作为测试液，同时设置空白对照(即0%)。取5ml测试液于小烧杯中，每个处理组设置3个平行，每个小烧杯中放入10个轮虫(龄长在10小时之内)，24小时和48小时后观察轮虫存活情况，记录并计算对轮虫产生影响的半数效应浓度(Median effective concentration，EC50)和最低无稀释效应浓度(Lowest ineffective dilution，LID)，并据此推测废水综合毒性[10]。

上述可见，轮虫作为在给水和排水系统中常见的一类微型生物，它容易取材和培养、操作简单，通过整合实验内容，在水处理生物学实验教学中可以有着很好的应用；而且，作为一种理想的实验材料，在教师科研中也有着较好的应用[11]，值得进一步推广使用。

[参考文献]

[1]Scheriber H., Schoenen D., Traunspurger W. Invertebrate colonization of granular activated carbon filters [J]. Water Research, 1997, 31(4): 743-748.

[2]李小伟, 刘丽君, 杨宇峰. BAC滤池水生动物的控制研究[J]. 给水排水, 2007, 33(11): 7-12.

[3]刘丽君, 张金松, 李小伟, 安娜, 乔铁军. 生物活性炭吸附池无脊椎动物群落变化及对水质影响[J]. 给水排水, 2010, 36(4): 7-11.

[4]尹文超, 张金松, 刘丽君, 赵岩, 李拓, 林超. 砂垫层控制活性炭滤池无脊椎动物穿透研究[J]. 哈尔滨工业大学学报, 2013, 45(2): 41-46.

[5]顾夏声, 胡洪营, 文湘华, 王慧. 水处理生物学(第5版)[M]. 北京：中国建筑工业出版社, 2011.

[6]USEPA, 1985. Methods for measuring the acute toxicity of effluents to freshwater and marine organisms. In: Peltier WH, Weber CI (eds) EPA/600/4-85/013 [M]. US Environment Protect Agency, Washington DC, p 216.

[7]章宗涉, 黄祥飞. 淡水浮游生物研究方法[M]. 北京：科学出版社, 1991, 410-411.

[8]Dahms H.U., Hagiwara A., Lee J.S. Ecotoxicology, ecophysiology, and mechanistic studies with rotifers [J]. Aquatic Toxicology, 2011, 101: 1-12.

[9]ASTM. Standard guide for acute toxicity tests with the rotiferBrachionus. Annual book of ASTM standards vol. 11.04, E1440 [M]. Philadelphia, PA, USA: American Society for Testing and Material, 1991.

[10]周永欣, 章宗涉. 水生生物毒性试验方法[M]. 北京：农业出版社, 1989, 109-133.

[11]Xu XP., Xi YL., Chu ZX., Xiang XL. Effects of DDT and dicofol on population growth ofBrachionuscalyciflorusunder different algal (Scenedesmusobliquus) densities [J]. Journal of Environmental Biology, 2014, 35(5): 907-916.

[中图分类号]G61

[文献标识码]B

[文章编号]1674-2273(2015)06-0098-02

作者简介][第一 徐晓平(1979 - )，男，安徽当涂人，安徽工程大学建筑工程学院讲师，博士，研究方向：水污染生态学。

[基金项目]安徽工程大学青年科研基金(2015YQ01)

[收稿日期]2015-06-18