虫草素的合成

刘 君，丁 杰，何 巍，谢 欢，梁兴勇

(四川理工学院化学与制药工程学院，四川自贡 643000)

虫草素又称 3'-脱氧腺苷，由 Cunningham［1］于1950年第一次从蛹虫草中分离得到。生物学研究发现虫草素具有抗肿瘤、抑菌、抗病毒、消炎等［2］广谱生物活性和药理作用。近年来研究人员发现虫草素可能具有增强人类免疫力［3］和清除因老龄化引起的体内自由基的功效［4］。另外，临床上已有以虫草素为主要成分的新药用于白血病的治疗［5］，应用前景良好，因此具有巨大的市场潜力。但是，虫草素纯品的获得非常不易，因此国际市场上虫草素的价格非常昂贵。

目前，虫草素纯品主要通过从人工培育的蛹虫草中提取分离得到，操作繁琐、制备成本较高［6］。为了大规模的获取虫草素用于生物活性研究，我们首先尝试了对虫草花进行分离，但是最终只获得500 mg样品，纯度约93%。该方法成本太高，因此我们试图通过化学合成的方法获取虫草素。

通过对骨架分析可知，虫草素由一个3-脱氧的核糖和腺嘌呤进行糖苷化连接而成。目前文献报道的虫草素的化学合成工艺主要有两种:一是以腺苷(1)为原料，通过将1的3'-位羟基溴代，接着用自由基还原去除3'-位的卤素制备虫草素［7］;二是利用木糖为原料通过多步基团保护，单独裸露出3-位羟基，接着用自由基还原反应制得3-脱氧核糖，再与1进行糖苷化连接制得虫草素［8］。

本文以1为原料［9］，经3步反应简单快速地合成了虫草素。即1与原乙酸三甲酯在醋酸作用下反应制得2'，3'-羟基原酸酯化的中间体(2)，接着加入乙酰溴，水解2'，3'-原酸酯，通过一锅两步法以40.5% 的收率制得 2'，5'-O-二乙酰基-3'-溴代腺苷(3);3在三丁基氢化锡和偶氮异二丁腈(AIBN)作用下经还原脱溴反应制得2'，5'-O-二乙酰基-3'-脱氧腺苷(4);4经水解去除糖环羟基上的乙酰基合成了虫草素，3步总收率29.8%，纯度＞95%，其结构经1H NMR和MS确证［7］。本文还重点对3的合成条件进行了优化。

Scheme 1

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

UV1900型双光束紫外分光光度计;Bruker 400 MHz型核磁共振仪(DMSO-d6为溶剂，TMS为内标);Hitachi型高效液相色谱仪;5500 Q-Trap型液质联用仪。

高效薄层层析板，青岛海浪;柱层析用硅胶，200目～300目，青岛海洋化工厂;Sephendex LH-20，北京绿百草公司;其余所用试剂均为分析纯，爱斯特试剂公司，其中醋酸、甲苯和甲醇使用前经干燥和纯化。

1.2 合成

(1)3的合成

在反应瓶中依次加入1 10.0 g(37.5 mmol)和冰醋酸75 mL，氮气保护，水浴冷却，搅拌下缓慢滴加原乙酸三甲酯14.4 mL(112 mmol)，滴毕;于室温反应过夜(TLC检测);冰水浴冷却下反应15 min;缓慢滴加乙酰溴 7.6 mL(93.7 mmol)(30 min);升温至20℃，反应6 h(TLC检测)。低温蒸去大部分乙酸和过量乙酰溴，残余物用氯仿(80 mL)溶解，用饱和NaHCO3溶液调至pH 7～8，依次用水和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，蒸干溶剂后经硅胶柱层析［洗脱剂:A=V(DCM)∶V(MeOH)=15 ∶1］纯化得黄色油状物 3 6.26 g，收率40.5%;MSm/z:414，416{［M+H］+}。

(2)4的合成

在反应瓶中加入3 5.53 g(13.4 mmol)和无水甲苯67 mL，搅拌使其溶解;加入AIBN 0.44 g(2.68 mmol)，于室温反应10 min;氮气保护下滴加三丁基氢化锡 5.8 g(20.1 mmol)，滴毕;回流(110℃)反应2 h(TLC检测)。倾入100 mL轻石油醚中(析出淡黄色固体)，过滤，滤饼用冰轻石油醚洗涤得4粗品3.87 g，收率87.0%，直接进行下步反应。

(3)虫草素的合成［8］

在反应瓶中依次加入无水甲醇37 mL和4 640 mg(1.87 mmol)，搅拌使其溶解;回流反应3 h(TLC检测)。缓慢冷却至室温，减压浓缩后经Sephendex LH-20柱层析［洗脱剂:V(H2O)∶V(MeOH)=10∶1］纯化得淡黄色固体虫草素405 mg，收率 85.1%，Rf=0.3(展开剂:A=4 ∶1)，m.p.226 ℃ ～228 ℃，［α］20D- 35.2 °(c0.10，MeOH);UV-Vis(CH3OH)λmax:213，260 nm;1H NMR δ:8.36(s，1H，2-H)，8.15(s，1H，8-H)，7.30(s，2H，NH2)，5.87(d，J=6.0 Hz，1H，1'-H)，5.69(d，J=5.6 Hz，1H，2'-H)，5.19 ～5.17(m，1H，5'-OH)，4.57(s，1H，2'-OH)，4.34(s，1H，4'-H)，3.69 ～3.66(m，1H，5-Ha')，3.51 ～3.46(m，1H，5-Hb')，2.27 ～2.20(m，1H，3-Ha')，1.93～1.90(m，1H，3-Hb')(与文献［8］值一致);MSm/z:274.1{［M+Na］+}。

2 结果与讨论

2.1 合成

本文参照文献方法通过两步反应合成3:一是1的环化;二是乙酰溴开环。实验中我们发现该反应虽然收率较好，但伴随生成的副产物5(Chart 1)较多，很难分离纯化。其次，第一步反应产物2在乙酸乙酯、二氯甲烷及乙醚中的溶解性均较差，只在氯仿中有一定的溶解度。因此，萃取时氯仿用量较大。此外，由于第二步反应中DMSO会干扰反应的进行(DMSO会和原位生成的HBr反应)，所以需要将其尽量除净。文献方法通过大量水洗和柱层析处理，后处理操作步骤较为繁琐。在第二步溴解反应中，我们发现按文献方法操作，3/5=4/1，选择性不理想，给后处理分离纯化带来了较大困难。

Chart 1

2.2 反应条件优化

在1的原酸酯化反应中，为了克服现有方法的缺点，寻找更加合理的合成工艺，对反应的溶剂进行了筛选，考察不同溶剂对反应的影响，结果见表1。由表1可见，以 DMSO为溶剂时，2收率82%;以醋酸和DMF为溶剂时，收率较高，分别为72%和65%，且杂质较少，可以作为DMSO的替代溶剂;乙腈和二氯甲烷为溶剂时收率较低，不能作为替代溶剂。

在2的溴解反应过程中，考察了溶剂对反应的影响，结果见表2。首先参照文献［9］方法以乙腈为溶剂时，以78%的收率获得3和5的混合物，3/5=4/1［较文献值(6/1)稍低］;尝试以乙酸为溶剂，3和5总收率为63%，3/5最佳能达6/1。因此在进行溴解反应时，乙酸可作为较佳溶剂。

表1 溶剂对腺苷原酸酯化反应的影响*Table 1 Effect of the solvent on ortho-esterification

鉴于此，可将原酸酯化反应和溴解反应合并进行，反应以40.5%收率制得3和5，3/5=6/1。该方法提高了反应选择性的同时也简化了后处理程序。由于醋酸的沸点相对较低，因此可以在低温下将乙酸和过量乙酰溴蒸馏出，大大简化了后处理难度。但是反应选择性一般，需进一步改进以利于工业化生产。

3 结论

以廉价易得的腺苷(1)为原料，经3步反应以29.8%总收率成功合成了具有抗肿瘤、抑菌、抗病毒活性的天然产物虫草素。合成中间体2'，5'-O-二乙酰基-3'-溴代腺苷的最佳反应条件为:1 37.5 mmol，醋酸 75 mL(作为溶剂和催化剂)，将原乙酸三甲酯112 mmol在冰水浴条件下缓慢滴加入体系，于室温反应过夜;冰浴条件下，将乙酰溴93.7 mmol在30 min内缓慢滴加入反应体系，于20℃反应6 h，收率40.5%。

该改进方法为虫草素工业化合成提供了新的途径。

［1］Cunningham K G，Manson W，Spring F S，et al.Cordycepin，a metabolic product isolated from cultures of Cordyceps militaris(Linn.)Link［J］.Nature，1950，166:949-951.

［2］Paterson R R.Cordyceps-A traditional Chinese medicine and another fungal therapeutic biofactory?［J］.Phytochemistry，2008，69(7):1469 -95.

［3］Ng T B，Wang H X.Pharmacological actions of Cordyceps，a prized folk medicine［J］.Pharm Pharmacol，2005，57(12):1509 -1519.

［4］Jeong M H，Seo M J，Park J U，et al.Effect of cordycepin purified from Cordyceps militaris on Th1 and Th2 cytokines in mouse splenocytes［J］.J Microbiol Biotechnol，2012，22(8):1161 -1164.

［5］Ramesh T，Yoo S K，Kim S W，et al.Cordycepin(3'-deoxyadenosine)attenuates age-related oxidative stress and ameliorates antioxidant capacity in rats［J］.Exp Geronto，2012，47(12):979 -987.

［6］Kodama E N，Meeafrey R P，Yusa K.Antileukemic activity and mechanism of action of cordycepin against terminal deoxynucleotidyl transferase-positive(TdT+)leukemic cells［J］.Biochem Pharmacol，2000，59(3):273-281.

［7］王英娟，李多伟，王义潮，郑婷婷.蛹虫草中虫草素、虫草多糖综合提取工艺研究［J］.西北植物学报，2005，25(9):1863 -1867.

［8］Robins M J，Wilson J S，Madej D Low，et al.Nucleic acid related compounds.88.Efficient conversions of ribonucleosides into their 2'，S'-anhydro，2'(and S')-deoxy，2'，3'-didehydro-2，3'-dideoxy，and 2，3'-dideoxynucleoside analogues［J］.J Org Chem，1995，60(24):7902-7908.

［9］Meier C，Huynh D T.Improved conversion of adenosine to 3'-deoxyadenosine［J］.Synlett，1991，4:227 -228.

［10］Kumar A，Khan S I，Manglani A，et al.Synthesis and antifungal activity of 3'-deoxyribonucleosides［J］.Nucleosides and Nucleotides，1994，13(5):1049-1058.

［11］Herdewijn P.Reaction of adenine nucleosides，tosylated in the carbohydrate moiety，with lithium triethylborohydride［J］.Tetrahedron，1989，45(20):6563-6580.

［12］Hansske F，Robins M J.Regiospecific and stereoselective conversion of ribonucleo sides to 3'-deoxynucleosides.A high yield three-stage synthesis of cordycepin from adenosine［J］.Tetrahedron Letters，1985，26(36):4295 -4298.

［13］Xiao Q，Li Q H，Yang R C.Total synthesis of cordycepin［J］.Chin J Org Chem，2013，33:1340.

［14］涂红艳.从腺苷合成虫草素的工艺研究［D］.杭州:浙江大学，2006.