五华鸡J亚群禽白血病的初步净化

李柔,盛昌树,徐前明,陈兴勇,耿照玉*

1.安徽农业大学动物科技学院,安徽合肥230036

2.安徽省芜湖市畜牧兽医局,安徽芜湖241000

五华鸡J亚群禽白血病的初步净化

李柔1,盛昌树2,徐前明1,陈兴勇1,耿照玉1*

1.安徽农业大学动物科技学院,安徽合肥230036

2.安徽省芜湖市畜牧兽医局,安徽芜湖241000

禽白血病是由白血病/肉瘤病毒群引起的禽类多种肿瘤型疾病的总称。该病目前尚未有有效的商品化疫苗，控制禽白血病最主要手段是病原体的净化。试验选用繁昌某五华种鸡场父母代鸡群为研究对象，前后5次采集血样共3059份，子代1日龄雏鸡肛门棉拭子采集样本1262份。ELISA法对该群体进行了J-亚群禽白血病（Avian leukosisvirus-J subgroup,ALV-J）的抗原、抗体筛查，ALV p27抗原检测试剂盒检测了子代1日龄胎粪中ALV p27含量。分析ELISA检测ALV-J阳性率表明，种鸡ALV-J阳性率较高，达40%；五华鸡保种场的子代雏鸡第1～4批ALV-J阳性率分别为9.09%、5.53%、1.42%、1.30%。由此可见，该场五华鸡父母代鸡群经过1个世代，4批次子代的净化，取得较为理想的效果。分析结果可为后期J亚群禽白血病的持续净化提供基础数据。

五华鸡;J亚群禽白血病;初步净化

禽白血病(Avian leukosis，AL)是指由反转录病毒科中禽反转录病毒属的成员禽白血病/肉瘤病毒群病毒(ALV/RSv)引起禽类各种可传播的良性和恶性肿瘤。在临床上可引起禽的肿瘤性疾病、生产性能下降以及免疫抑制等危害，且其可垂直传播造成本病在种群世代间持续存在。由鸡分离的ALV划分为A、B、C、D、E和J 6个亚群，其中J-亚群禽白血病病毒(Avian leukosisvirus-J subgroup,ALV-J)是一种新的外源性ALV，它比经典ALV具有更强的致病性和传播能力[1]。研究表明，J亚群ALV在流行病学上表现出新的特点，如感染宿主种类、日龄等范围明显扩大，混合感染严重[2]。目前，禽白血病尚无有效的治疗方法和疫苗，给禽白血病的防治带来了很大的难度。

五华鸡作为国家级畜禽遗传资源保护品种，具有性情活泼、敏捷、觅食力强、抗病性强、肉鲜味美、肉质细嫩等特点。随着禽白血病向地方品种鸡蔓延的趋势，胡晓苗等在对五华鸡开展ALV-J血清学调查中，发现繁昌五华鸡也已出现J亚群禽白血病感染的情况，并从解剖病变和组织病理学等方面对其进行了深入的观察研究，得以确诊[3]。当前，许多学者开展了从切断该病的垂直传播途径入手净化种鸡场，采取综合防治措施控制该病，从而建立无禽白血病的健康鸡群[4]。p27是ALV核衣壳蛋白的群特异性抗原，具有高度保守性，利用该基因检测可反映鸡群感染ALV状况。现行检测ALV的方法有多种，如PCR技术，琼脂扩散试验等，其中以ELISA方法操作简便、快速，是适合于种群净化的普检方法。本试验采用ELISA法制定五华鸡祖代鸡J亚群禽白血病的净化方案，研究结果为控制禽白血病在该种鸡群中蔓延，保护地方鸡品种资源提供有益的借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物五华鸡慢羽保种鸡群，选自繁昌某五华鸡保种场，保种群父母代1批，子代4批次。

1.1.2 试剂盒采用美国IDEXX公司ALV-J抗体检测试剂盒检测血清中的ALV-J抗体，ALV p27抗原检测试剂盒（同样来自美国IDEXX公司），其主要组成见表1。

表1 ALV p27抗原的ELISA试剂盒组成Table 1 ELISA Kit composition for detection of ALV p27Ag

1.1.3 仪器酶标仪：Model 680自动EUSA检测仪，美国BIO-RAD公司；精密单道移液器和多道移液器：德国eppendorf公司；培养箱：德国Memmert公司。

1.2 方法

1.2.1 样本采集选取繁昌地区最大的代表性龙头企业种鸡场（年产种苗在400万只以上），分别于2012年7月20日、8月14日、10月30日和2013年2月1日、4月1日对3100只留种慢羽母鸡和300只留种慢羽公鸡进行了5次采血及双拭子采集，共收集血清样本3059份，双拭子样本1262份。对于子代雏鸡4700只采集胎粪或泄殖腔棉拭子，经PBS溶液处理后分离上清备用。

1.2.2 间接ELISA检测ALV-J抗体血清和蛋清制备方法参照张恒等报道[5]，并经56℃灭活30 min，-20℃冷冻、备用。蛋清制备方法在去除蛋黄后，加入青链霉素双抗后经PBS溶液稀释后-20℃冷冻、备用。检测方法参照禽白血病J亚群抗体检测试剂盒说明书，判定过程依表2。

表2 禽白血病J亚群抗体检测结果判定Table 2 The judgement for antibody test of ALV-J

1.2.3 p27抗原检测从肛门挤出胎粪，胎粪置于1 mL ddH2O灭菌离心管中；胎粪已经排出的，采取泄殖腔棉拭子法进行收集，胎粪样品应摇匀。粪样经反复冻融，使更多的病毒粒子暴露，应用于ALV p27抗原检测试剂盒检测。

泄殖腔棉拭子参照试剂盒说明书，判定标准见表3。

表3 禽白血病p27抗原检测结果判定Table 3 The judgement for p27 antigen of ALV-J

1.2.4 五华保种鸡群J亚群禽白血病的净化方法（1）母系净化第一轮净化选择26～28 w收集初生蛋后，采用ELISA方法对蛋清中p27抗原检测，若发现为阳性者应淘汰；第二轮检测34 w母鸡（第一轮为阴性）血清以及泄殖腔棉拭子抗原，阳性者淘汰，阴性者同时检测血清J抗体，若3项均为阴性，该个体留种作配套纯系的原种群。

（2）父系净化第一轮净化选择26 w鸡群，采集血清和泄殖腔棉拭子样本后，先检测肛拭p27抗原，阳性者淘汰；若p27抗原检测为阴性者，检测其血清J抗体，若3项均为阴性的个体，留种作配套纯系的原种群。第二轮筛查为34 w，检测和留种依据同上。

2 结果与分析

2.1 五华种鸡J亚群禽白血病的净化结果

经过5次样本采集与筛选，最后确定465只阴性慢羽母系以及75只阴性慢羽父系，作为后续试验的阴性父母代。由表4可知，繁昌五华鸡母鸡J亚群禽白血病平均阳性率明显高于公鸡（P＞0.01）。

表4 5次种鸡血清及棉拭子检测结果Table 4 Serum and cotton swab test results of breeder chicks in 5 times

2.24 批次雏鸡净化

为确保净化工作的有效性，试验采用家系和个体淘汰制，即各家系后代中出现阳性个体，则淘汰此家系中所有雏鸡及其母本，父本视其他母本及其雏鸡的阳性感染情况而定。

4批净化结果见表5。经过4批次雏鸡净化，禽白血病阳性率逐步下降，在第一批次中阳性率为9.09%，经过几轮净化后，第四批次降至1.30%。期间共淘汰低产及可疑为阳性的留种母系255只，剔除精液量持续较少及可疑为阳性的留种父系43只。剩余阴性母系198只，阴性父系28只，阴性留种父母代共计226只。

表5 4批次雏鸡1日龄胎粪检测结果Table 5 Meconium test results of 1 day old chickens in 4 batches

3 讨论

黄兴国等对清远麻鸡祖代开展禽白血病净化，进行连续3个世代的泄殖腔拭子采样和ELISA检测，及时淘汰阳性鸡。清远麻鸡祖代鸡第1世代(G1)阳性率为14.01%，其中公鸡的阳性率为19.04%，母鸡阳性率为8.16%；第2世代(G2)阳性率为9.05%，其中公鸡的阳性率为15.52%，母鸡的阳性率为8.16%；第3世代(G3)阳性率为4.15%，其中公鸡的阳性率为6.93%，母鸡的阳性率为3.40%[6]。可见ELISA法用于J亚群禽白血病的净化在早期可以起到较好的净化效果。本试验主要对五华鸡子代鸡群开展J亚群禽白血病的净化，从净化效果看，仍存在较低的阳性率（第四批阳性率1.30%）。ELISA法检测p27抗原作为判断J亚群禽白血病的依据，但无法检测所有外源性禽白血病病毒，可能是导致净化不完全的主要原因。同时，伴随禽白血病病毒净化工作的继续，鸡群检测p27抗原的ELISA阳性检出率会逐渐下降。本试验中繁昌五华鸡公鸡的阳性率明显低于母鸡，有报道称公鸡的生殖细胞中没有禽白血病病毒的繁殖，仅作为病毒携带者并接触传染给其他鸡[7]，且睾酮可以增强机体对禽白血病病毒的抵抗力，此外，种鸡生产中常采用人工授精，大大减少了公鸡携带病毒的水平传播。

赵鹏等认为，1个苗箱内运输的雏鸡中若存在1只鸡胎粪中带毒，则可能造成20%～30%鸡只感染禽白血病病毒[8]。可见，1日龄禽白血病检测及淘汰很难彻底清除外源性禽白血病病毒。张胜斌等跟踪不同日龄蛋鸡ELISA检测结果，显示开产初期和产蛋高峰期p27的阳性检测率明显升高，公、母鸡阳性率检出高峰期亦存在明显差异，即ALV-J阳性检出率受日龄的影响[9]。本研究小组分析禽白血病相关基因Mx1多态与禽白血病阳性率相关性，推测禽白血病阳性检出率可能随日龄而发生变化（已接收，未发表）。因此，有必要继续跟踪五华鸡子代后续ALV-J阳性检出率，探明ALV-J在其生长过程中的阳性检出规律，依此规律，可以开展公、母鸡分阶段分别净化工作，以加快净化速度，保证净化效果。

[1]BAI J,PAYNE LN,SKINNER MA.HPRS-103(exogenous avian leukosis virus，subgroup J)has an env gene related to those of endogenous elements EAV-0 and E51 and an E element found previously only in sarcoma viruses[J].Journal of Virology,1995,69:779-784

[2]崔治中.我国鸡群白血病流行病学和防控技术研究现状[C]//崔治中.中国畜牧兽医学会禽病学分会第十六次学术研讨会论文集.北京:中国学术期刊电子杂志出版社,2012:1

[3]胡晓苗,戴银,潘孝成,等.安徽省五华鸡J亚群禽白血病的鉴定及其病理学观察[J].中国动物传染病学报,2012(3):22-26

[4]张贺楠,黄秀英,刘长清.蛋种鸡场禽白血病净化研究[C]//张贺楠.中国畜牧兽医学会家禽学分会.安全优质的家禽生产——第十五次全国家禽学术讨论会论文集.北京:中国学术期刊电子杂志出版社,2011:5

[5]张恒,李传龙,杨明,等.禽白血病A亚群病毒gp85的单因子血清制备及其特异性鉴定[J].微生物学报,2011,01:134-140

[6]黄兴国,高明超,王政富,等.清远麻鸡禽白血病净化效果的观察[J].黑龙江畜牧兽医,2012,21:105-108

[7]欧阳金旭.ALV-J动物疾病模型的建立及囊膜基因分析[D].荆州:长江大学动物科技学院,2012:8

[8]赵鹏,崔治中,马诚太.种蛋中禽白血病病毒P27抗原检出率与鸡群禽白血病发病率的相关性研究[J].畜牧兽医学报,2012,10:1618-1622

[9]张胜斌,吴天威,韦平,等.地方优良鸡种禽白血病病毒感染调查及净化[J].中国家禽,2010,12:11-16

Preliminary Eradication forAvian leukosisVirus-J Subgroup in Wuhua Chicken

LI Rou1,SHENG Chang-shu2,XU Qian-ming1,CHEN Xing-yong1,GENG Zhao-yu1*
1.College of Animal Science and Technology/Anhui Agricultural University,Hefei230036,China
2.Wuhu Bureau of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Wuhu241000,China

Avian leukosisvirus(ALV)is the most common oncogenetic retrovirus that emerges spontaneously as a result of recombination between exogenous viruses,exogenous viruses and endogenous viruses,and exogenous viruses and non-homologous cellular genes.While there are no effective commercialized vaccines,pathogen eradication might be more operational.Parental group from Fanchang Wuhua breed conservation station were used for pathogen eradication,5 batches with a total of 3059 blood samples were collected during July 2012 to April 2013.In addition,1262 anal swab samples from 1 day old chicks were also collected.Antigen and antibody ofALV-J from blood samples were screened using ELISA method. Anal swab samples were also detected using ALV p27 antigen detection kit.The results showed that positive ALV-J in parental group was high to 40%.ALV-J positive rate to the four batches was 9.09%、5.53%、1.42%and 1.30%,respectively. In conclusion,theALV-J positive rate was controlled in a very low percentage in parental group after this eradication process. These results could be meaningful for the further eradication ofALV-J.

Wuhua chicken;Avian leukosisvirus J-subgroup;preliminary eradication

S831.7

:A

:1000-2324(2015)06-0870-04

2013-01-23

:2014-03-19

安徽省科技攻关项目(12010302058)

李柔(1991-),女,硕士在读,主要从事家禽遗传育种研究.E-mail:1292284829@qq.com

*通讯作者:Author for correspondence.E-mail:gzy@ahau.edu.cn