菰黑粉菌中Ueubc2的克隆及表达分析

余佳佳，张雅芬，崔海峰，俞晓平，叶子弘

（中国计量学院生命科学学院/浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室，310018）

菰黑粉菌中Ueubc2的克隆及表达分析

余佳佳，张雅芬，崔海峰，俞晓平，叶子弘

（中国计量学院生命科学学院/浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室，310018）

茭白是我国第二大水生蔬菜，它的形成与其内生真菌菰黑粉菌的侵染密切相关。根据菰黑粉菌转录组数据库设计特异引物，采用RT-PCR扩增获得Ueubc2基因，序列分析发现Ueubc2是玉米瘤黑粉菌中ubc2的同源基因，编码蛋白含有SAM、RA、SH3结构域，作用于MAPK信号通路。同时通过实时荧光定量PCR对Ueubc2基因进行表达分析，发现在融合生长过程中Ueubc2上调表达，并在菌丝形成时其表达量最大，随着菌丝生长表达量逐渐降低，表明其在菰黑粉菌真菌二型态转变过程中具有重要作用。

菰黑粉菌；二型态转换；Ueubc2

1 材料与方法

1.1 试验材料

本课题组前期分别从龙茭2号正常茭和灰茭中分离得到的菰黑粉菌MT-1、T-1。

1.2 试验培养基

YEPS培养基：酵母提取物10 g，胰蛋白胨20 g，蔗糖20 g，蒸馏水1 000 mL；固体培养基另加15 g琼脂；LB培养基：胰蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，NaCl 10 g；固体培养基另加15 g琼脂。

1.3 Ueubc2基因片段的扩增

①菰黑粉菌总RNA和DNA提取 收集适量菰黑粉菌，在液氮中充分研磨成粉末，根据Trizol试剂提取说明书提取菰黑粉菌总RNA。DNA提取则用CTAB法。

②Ueubc2基因相关大片段的扩增 根据菰黑粉菌反转录数据库进行信息学分析，得到Ueubc2基因预测片段，根据预测结果设计特异引物Ueubc2-F1和Ueubc2-R1（表1），采用普通PCR以基因组DNA为模板扩增菰黑粉菌中该基因的已知片段，经割胶回收后，通过TA克隆转化大肠杆菌，挑取阳性克隆，进行测序验证。经NCBI的BLAST功能检测，确定该片段包含Ueubc2基因的完整序列，并包括部分上下游基因。

③菰黑粉菌Ueubc2基因组序列的克隆 根据②扩增片段测序结果，设计特异引物Ueubc2-gF和Ueubc2-gR，以DNA为模板扩增Ueubc2基因完整序列，并测序。

④菰黑粉菌Ueubc2 cDNA全长序列的扩增 采用 PrimeScriptRT regent Kit With gDNA Eraser反转录试剂盒合成菰黑粉菌总RNA的cDNA第1链。根据已扩增片段分析结果，设计引物Ueubc2-F2和Ueubc2-R2扩增目的基因cDNA完整序列，经克隆测序验证。然后通过NCBI的BLAST功能，同其他已知物种进行氨基酸序列同源性比对，并利用MEGA软件进行序列分析，用Neighbor-joining方法构建系统发育树和多重序列比对图谱，并根据同源性来预测Ueubc2编码蛋白的功能。

1.4 Ueubc2基因表达模式分析

①样品采集观察 以YEPS固体培养基分别培养从龙茭2号正常茭和灰茭中分离得到的菰黑粉菌，先分别在YEPS液体培养基中培养至菌浓度OD600为2.0。以OD600为2.0的菰黑粉菌为初始浓度，分别取100 μL菌液，涂布YEPS固体平板，分别培养0、12、24、36、48、60 h后收集菌体。试验重复3次，收集的菌体用液氮速冻，-80℃保存。

②荧光实时定量PCR检测基因的相对表达量

菰黑粉菌总RNA的提取及其cDNA的合成方法同1.2，利用获得的Ueubc2cDNA序列，按照qRT-PCR引物设计要求设计荧光特异性引物（表1）。以β-actin基因作为内参基因，以YEPS固体培养基上分别培养0、12、24、36、48、60 h的cDNA为模板进行定量 PCR扩增。荧光定量PCR采用SYBR Green I染料法，反应在StepOneTMReal-Time PCR System（ABI）检测系统上进行。PCR反应液体系为：10 μL SYBR Premix Ex TaqTM，0.5 μL PCR Forward Primer（10 μmol/L），0.5 μL PCR Reverse Primer（10 μmol/L），0.5 μL cDNA模板，8.5 μL PCR水。反应程序为 95℃ 30 s；95℃ 30 s，54℃ 20 s，72℃延伸30 s，进行40个循环，每个反应设置3个重复样品。根据实时荧光定量PCR得到的Ct值以及标准曲线，采用2-ΔΔCt法计算Ueubc2的相对表达量[20]，同时对其进行显著性差异分析。

2 结果与分析

2.1 菰黑粉菌Ueubc2基因的全长克隆及序列特征分析

根据前期菰黑粉菌转录组数据库信息，设计了特异引物（表1）扩增了Ueubc2目的基因和开放阅读框。根据Ueubc2-F1和Ueubc2-R1引物以菰黑粉菌DNA为模板扩增得到4 091 bp（图1）的序列，对测序结果根据NCBI数据库中的Blast功能进行信息学分析，确定该序列包含Ueubc2完整序列和部分上下游序列。再根据信息学结果设计引物Ueubc2-gF和Ueubc2-gF，以DNA为模板扩增得到2 562 bp序列（图1），经Blast功能分析发现该蛋白与玉米瘤黑粉菌中的ubc2基因具有较高的同源性，包括了的TAG终止密码子和ATG起始密码子，是完整序列。再以Ueubc2-F2和Ueubc2-R2引物，以cDNA为模板扩增该目的基因的开放阅读框，得到2 562 bp片段（图1），而基因组扩增得到的Ueubc2完整序列也是序列2 562 bp，说明该目的基因内部不含内含子。

经ExPasy预测，Ueubc2基因编码了853个氨基酸，蛋白分子量约为90.42 kDa，理论等电点为8.09。通过NCBI中的BLAST比对结果表明，该序列与其他真菌中的MAPK信号通路调控蛋白具有高度同源性，特别与玉米黑粉菌中的Ubc2蛋白结构很相似，因此我们将其命名为Ueubc2（GenBank登陆号KT779549）。

2.2 Ueubc2蛋白结构及系统发育分析

根据文中2.1获得的Ueubc2目的基因和开放阅读框序列测序结果，将基因翻译成氨基酸序列，使用Blast中蛋白比对功能与NCBI数据库中所有蛋白进行比对。结果表明，该蛋白具有SAM结构域（sterile alpha motif domain）、RA结构域（ras association domain）和2个SH3结构域（Src homology 3 domain）33种特征结构（图 2）。而玉米瘤黑粉菌中的Ubc2蛋白也存在这3个结构域，说明我们的Ueubc2与Ubc2蛋白很可能具有相似功能。为了研究Ueubc2与其他真菌中具有相似结构的衔接蛋白进行进化分析，筛选了部分亲缘关系较近真菌构建进化树，如图3。从图中可知菰黑粉菌Ueubc2蛋白与大麦坚黑粉菌（Ustilago hordeiCCF49723.1）、玉米瘤黑粉菌（XP_011391983）、玉米丝黑穗病黑粉菌（Sporisorium reilianumCBQ70036）、宾地瘤黑粉菌（Melanopsichium pennsylvanicum4 CDI56086）亲缘关系较近。说明Ueubc2蛋白确实与玉米瘤黑粉菌中的Ubc2蛋白属于同类蛋白。将菰黑粉菌Ueubc2蛋白与以上4种真菌中的MAPK信号途径中的衔接蛋白进行比对，如图4。因为比对的蛋白较大，所以就截取了部分比对序列，但从图中还是可以看出这5种真菌衔接蛋白的结构还是具有一些差异，但SAM（氨基酸位点13-79）、RA（氨基酸位点432-509）、2个SH3（氨基酸位点586-640；737-785）3种结构域在这5种蛋白质中都比较保守，只有少数几个碱基的差异。表明菰黑粉菌中该蛋白可能是比较重要的蛋白，具有与其他真菌类似的功能，可能也参与真菌的菌丝生长、致病性和有性生殖的过程。

2.3 Ueubc2基因在不同培养时间、菌落形态下的表达特征分析

将菰黑粉菌MT-1、T-1分别培养0、12、24、36、48、60 h后进行菌落显微观察，发现培养初期，菰黑粉菌菌落光滑（图 6C），边界清晰，培养后，T-1在12 h即可观察到形成的菌丝（图 6A），而MT-1在36 h可观察到形成的菌丝（图 6D）。收集菌体，通过荧光定量PCR分析Ueubc2的表达量，结果如图5，T-1茭白黑粉菌中Ueubc2基因表达量在12 h时最大，此时菌落开始生长菌丝；而MT-1茭白黑粉菌中Ueubc2基因表达量在36 h时最大，此时菌落在倒置显微镜下可以观察到菌丝生长，12 h时菌落边界较光滑（图 6B）。MT-1、T-1菰黑粉菌中Ueubc2的表达量趋势基本一致，Ueubc2基因表达量都是呈现先上升后下降的过程，但是在融合生长过程中该基因在T-1菌株中的表达量显著高于MT-1，同时从图 6可以看出T-1菰黑粉菌菌丝生长速度较MT-1快，可能与其生长能力相关。对Ueubc2基因在不同培养时间、菌落形态下的表达特征综合分析，推测Ueubc2基因可能与菰黑粉菌菌株融合和菌丝生长有关。

3 讨论与结论

茭白是我国第二大水生蔬菜，不但其本身营养丰富，口感也极佳，广受人民喜爱，是一种具有较高经济价值的健康蔬菜[6～8]。但至今茭白植株孕茭机制还不是很清楚，这就迫切需要我们投入更大的精力于茭白孕茭机制的研究。而前期研究已发现菰黑粉菌是茭白植株基部膨大成可食用肉质茎的关键，也在茭白组织切片中观察到黑粉菌，并成功从茭白中分离得到菰黑粉菌，为孕茭机制在基因水平的研究提供了基础。而菰黑粉菌的侵染能力又与真菌二型态具有密切联系，菌丝态真菌一般具有侵染宿主的能力[9]，如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）[9～10]、玉米瘤黑粉菌[11]。而真菌二型态的转变受cAMP和MAPK信号途径的协同调控[12～14]，本试验克隆得到的Ueubc2基因是MAPK信号途径上游的关键基因。结合Ueubc2蛋白结构及亲缘关系分析，可知该蛋白是玉米瘤黑粉菌Ubc2的同源蛋白，是MAPK信号通路中的上游基因[14]，Ueubc2基因的缺失，很可能会导致菰黑粉菌致病性的缺失。在玉米瘤黑粉菌Ubc2蛋白中存在3个保守结构域，SAM、RA和2个SH33种结构域（图2），它们是Ubc2蛋白行使功能不可缺少部分。SAM结构域普遍存在于信号蛋白和核蛋白中，以EPH-相关的酪氨酸激酶介导细胞与细胞间的的信号转导；RA结构域可能会与RasGTP蛋白结合，是假定的RasGTP效应器。它们参与真菌菌丝的生长，与真菌二型态转变有关[5]。SH3结构域是蛋白与蛋白间相互联系的部分，对于富含脯氨酸的序列具有更强的亲和性，优先与P×× P基结合。SH3结构域的蛋白具有多样的细胞作用，比如酶的调节、信号通路调控、介导蛋白复合体的组装等，是玉米瘤黑粉菌致病性产生的必须成分[5]。而在菰黑粉菌中也存在Ubc2同源蛋白，并且也具有与其高度同源的3个功能结构域。从Ueubc2基因在不同培养时间、菌落形态下的荧光结果可知，Ueubc2基因跟菰黑粉菌菌丝融合生长密切相关，且主要作用于菌丝形成初期，可能与其已知作用机制类似，在菰黑粉菌中，Ueubc2作用于信息素响应，从而启动MAPK信号途径来促进菌丝生长[5]。本试验通过对Ueubc2基因在菰黑粉菌中的表达水平来探索该基因在其二型态转变过程中的作用，为后期研究菰黑粉菌在茭白植株中菌丝态的形成时期，以及孕茭机制探索提供了实验基础。

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Cloning and Expression Analysis ofUeubc2inUstilago esculenta

YU Jiajia,ZHANG Yafen,CUI Haifeng,YU Xiaoping,YE Zihong
(College of Life Sciences,China Metering University;Zhejiang Provincial Key Laboratory of Biometrology and Inspection&Quarantine,Hangzhou,310018)

Zizania latifoliais the second aquatic vegetable in China.Its formation is closely releted the interaction which between its internally Endophytic fungus andUstilago esculenta.According to the transcriptome database ofUstilago esculenta,we designed the specific primers,using RT-PRC to amplify geneUeubc2.Sequence analysis showed that Ueubc2is the homologous gene ofubc2inUstilago maydis,and the encoding protein contains SAM,RA and SH3 domain, which acting on the MAPK signal pathway.At the same time,the expression analysis by real-time PCR revealed to gene Ueubc2was up-regulated during the mating progress,and reached highest when hyphae formed,then decreased during hyphae's growth,the result shows that it had an important role in the process of two type transformation ofUstilago esculenta.

Ustilago esculenta;two type transformation;Ueubc2

S645.2；Q786；Q781

A

1001-3547（2015）22-0202-06

10.3865/j.issn.1001-3547.2015.22.073

国家科技支撑计划项目（2012BAD27B01）；浙江省公益项目（2014C32022）；国家自然科学基金项目（3147085）

2015-10-14与菰黑粉菌二型态转变过程。本研究为进一步阐述菰黑粉菌菌丝形态发生的分子机制，探讨茭白的孕茭机理提供了理论基础。

茭白（Zizania latifoliaTurcz），古称为菰，是禾本科多年水生宿根性草本植物，原产中国及部分东南亚地区[1]。《周礼》中记载在公元前3世纪“菰”为六谷之一，是重要粮食作物[2]。茭白共生菌菰黑粉菌可以侵入茭白植株，使茭白茎基部膨大形成可食用茭白，该种肉质鲜美、营养丰富的膨大组织是我国长江流域以及以南地区广泛栽培的经济作物[1]。前期研究也发现在茭白膨大过程中，组织中菰黑粉菌（Ustilago esculenta）会大量增殖，在切片中可以观察到大量菌丝[3]。因此，菰黑粉菌与茭白的生产密切相关。

菰黑粉菌属于黑粉菌属真菌，具有典型的二型态生活史。而真菌的致病性与其二型现象具有紧密联系，酵母型真菌处于无性生殖状态，进行芽殖或裂殖；菌丝型的产生一般与真菌的有性生殖有关，该状态下的真菌具有侵染宿主的能力。菰黑粉菌同样具有酵母型和菌丝型2种型态，且在茭白膨大过程中菰黑粉菌也随之快速增殖，菌丝也大量生长，所以菰黑粉菌的侵染能力可能也与其近缘真菌玉米瘤黑粉菌（Ustilago maydis）类似，菌丝态的形成使真菌具有侵染能力[4]。真菌的二型态转变又与环磷酸腺苷/蛋白激酶A（cAMP/PKA）和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase,MAPK）信号途径相关，它们可以协同调控真菌菌丝的生长，并使真菌产生致病性。在玉米瘤黑粉菌中，MAPK信号途径可以调控真菌中交配型基因交联、型态转变和致病性。MAPK信号通路包含Kpp4/ Ubc4、Fuz7/Ubc5、Kpp2/Ubc3、Kpp6和Crk1。另外，ubc还存在其他2个基因，Ubc1蛋白参与cAMP/ PKA信号途径中PKA亚基的表达调控；Ubc2衔接蛋白调控信息素响应的MAP激酶信号通路和致病性产生的过程。ubc2基因位于MAPK信号通路最上游位置，ubc2基因发生突变，玉米瘤黑粉菌菌丝生长会受到抑制[5]。

本课题组前期对菰黑粉菌转录组进行分析，发现在菰黑粉菌中具有与玉米瘤黑粉菌ubc2基因序列相似基因，因此对本课题组前期分离得到的菰黑粉菌进行该基因序列和开放阅读框的PCR扩增，通过基因结构、同源性及系统进化分析表明，该基因与玉米瘤黑粉菌中ubc2基因具有较高同源性，故命名为Ueubc2。同时利用荧光定量PCR检测分析了不同培养时间诱导后Ueubc2在菰黑粉菌菌落二型态转化过程中的表达情况，发现菰黑粉菌菌落在从酵母型向菌丝型转化过程中Ueubc2基因的表达量具有明显的变化，其中在培养早期Ueubc2呈上调表达，并在菌丝开始形成时达到最大，之后随着菌丝大量形成，表达量逐渐降低，表明该基因参

余佳佳(1990-)，女，研究生，主要从事真菌与植物互作，E-mail：yji12579@163.com

叶子弘，通信作者，电话：0571-86836062，E-mail：zhye@cjlu.edu.cn