脂联素对钙化大鼠血管组织的影响

闫 亮，王 昆

脂联素对钙化大鼠血管组织的影响

闫 亮1，王 昆2

目的 观察脂联素及其受体在钙化大鼠血管组织中的变化，探讨脂联素(adiponectin, APN)对钙化组织的作用。方法 大鼠随机分为正常对照组、钙化组和脂联素组。制备大鼠血管钙化模型。用ELISA法测定血浆和血管组织中脂联素的含量，用real-time PCR方法检测组织中脂联素与其受体adipo R1的mRNA水平，用Western blot方法检测组织中受体adipo R1蛋白含量，测定血管中钙含量及碱性磷酸酶活性。结果 与对照组相比，钙化大鼠血浆和血管组织中脂联素的含量明显降低，分别降低了47.1% 和 57.1%；钙化组大鼠血管组织中APN 和adipo R1 mRNA 水平较对照组有显著降低，分别降低了65.0 %和72.0 %；钙化大鼠的血管组织中adipo R1蛋白降低了77.2%(均P<0.01)。给予脂联素的大鼠血管组织中钙含量和碱性磷酸酶活性分别降低68.5%和34.8% (P<0.01)。结论 钙化的血管组织中APN与其受体adipoR1系统是明显下调，APN可明显抑制钙化大鼠血管组织中钙含量和碱性磷酸酶的活性，提示APN可抑制维生素D3和尼古丁引起的血管钙化。

血管钙化；脂联素；脂联素受体

通常伴随着衰老、糖尿病、动脉粥样硬化、肾衰会出现血管钙化，导致心血管疾病。相关研究证实，血管钙化的过程是主动发生的且是可调控的，骨发育以及形成骨质疏松的过程也是主动调节的过程，两者有相似之处[1]。不过，当前还未明确血管钙化的形成机制。

脂联素(adiponectin,APN)是由脂肪组织分泌的一种细胞因子，与心血管疾病密切相关。脂联素通过抗炎、抗氧化、调节能量代谢等发挥对心血管的保护作用[2]。目前已确认有两种APN受体(R1和R2)。有研究发现，心血管组织中也有APN 受体的表达[3,4]。但钙化血管组织中APN及其受体adipo R1 的变化及外源性APN在血管钙化中有何作用并不明确。本研究所采用的大鼠模型经过维生素D3及尼古丁诱导而形成血管钙化，从而对发生钙化的血管其APN和受体变化、外源性APN对钙化血管的作用进行观察，以探讨APN在血管钙化中的作用和可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要试剂 雄性SD 大鼠(180～200 g)，由维通利华提供。维生素D3、VDN、ALP 试剂盒购自Sigma 公司，引物合成是北京奥科生物技术有限责任公司。APN检测试剂盒购自Invitrogen 公司。抗体APN受体R1购自Abcam公司。余为市售分析纯产品。

1.2 大鼠血管钙化模型制备 根据相关文献[3]制作大鼠血管钙化模型。将36只大鼠随机分为3组：(1)单纯钙化组(VDN，n=12)：实验第一天给予肌内注射300 000 U/ kg的维生素D3，将尼古丁溶于花生油(25 mg/kg)进行灌胃，并在9 h后第二次灌胃，之后每周2次给予0.2 ml生理盐水尾静脉注射；(2)钙化+APN组(n=12)：钙化处理后尾静脉注射脂联素10μg/次，每周2次，持续4周；(3)正常对照组(n=12):每周2次尾静脉注入生理盐水0.2 ml。

各组动物常规饲养4周后进行检测。通过腹腔注射乌拉坦1 g/kg进行麻醉， 在腹主动脉采血，肝素抗凝，离心机分离血浆，冻存于-70 ℃ 环境下以备用。6只大鼠主动脉血浆用ELISA方法检测APN浓度；另外，再用6只主动脉的血浆，冻存于-80 ℃条件下，取一部分通过Western blot检测APN受体adipo R1蛋白的含量，取另外一部分进行PCR检测APN及其adipo R1 mRNA水平。

1.3 主动脉钙含量测定和碱性磷酸酶活性测 取胸主动脉10～20 mg，80 ℃彻底烤干， 加入2 mol浓硝酸消化并烤干后，用去离子水(含27 nmol氯化钾和27 μmol氯化镧)复融，取1.5 ml 样品，加入1%氯化锶150 μl。用703 型原子吸收分光光度计在422.7 nm 波长下测定各管的吸光度值，从标准曲线上查出钙含量，并换算成μmol干重组织。

取10 mg左右主动脉并添加PBS 制备成匀浆，使用离心机进行10 min的离心，取上清液。用考马斯亮蓝法实施蛋白定量。参照Sigma ALP 测定试剂盒的使用说明书进行心血管组织中的碱性磷酸酶活性的测定。

1.4 RNA 提取和荧光实时定量PCR 取50～100 mg血管，用QIAGEN RNA提取试剂盒提取总RNA。脂联素的上游引物：5′-GTG TGG GAT TGG AGA CTT-3′，下游5′- TAG AGA AGA AAG CCT GTG A-3′， 扩增产物大小为128 bp。 脂联素受体adipo R1的上游引物：5′-AAC TGG ACT ATT CAG GGA-3′，下游5′- TGG TTC CAG TCT CAT CAG-3′，扩增产物大小为198 bp。管家基因GAPDH的引物序列如下:上游5′- ATG GTG AAG GTC GGT GTG-3′，下游5′- AAC TTG CCG TGG GTA GAG-3′， 扩增产物大小为161bp。运用ABI PRISM7000 实时定量PCR 仪扩增

PCR ，使用ABI公司的SYBR Green qPCR mix 试剂盒用于反应体系。扩增的条件是：95 ℃条件下进行10 s的预变性， 95 ℃温度条件下进行5 s的变性，在60 ℃ 温度条件下退火延伸20 s，反复操作40次，运用20 μl的反应体系。独立进行3次实验。

1.5 Western blot法检测血管组织中adipo R1蛋白表达水平 蛋白样品的提取以及蛋白的定量参照常规办法操作。取蛋白样品上样60 μg，通过10%的SDS-PAGE 电泳进行蛋白分离，蛋白质通过半干式电转移法转移至PVDF膜。用封闭液(含3%脱脂奶粉)进行1 h的封闭处理，添加adipo R1一抗(经1∶1000稀释处理)，在4 ℃条件下孵育一夜，经3次TBST 冲洗，添加二抗(经1∶400稀释处理)，在室温条件下经过1 h的孵育，经3次TBST 冲洗，用ECL显色且在X 胶片曝光，在凝胶图片分析系统中完成扫描分析处理及拍照。

2 结 果

2.1 钙化大鼠血浆和血管组织中APN含量变化 对照组血浆和血管组织中APN含量分别为(2.14±0.09)μg/ml、(0.28±0.07) mg/mg pro；钙化组血浆和血管组织中APN含量分别为(1.13±0.05)μg/ml、(0.12±0.06) mg/mg pro，和对照组比较，钙化的大鼠血浆以及血管组织中APN含量均有明显降低，分别降低了47.1% 和 57.1%(均P<0.01)。

2.2 钙化大鼠血管组织中APN及其受体adipo R1 mRNA的变化 real-time PCR显示：和对照组相比较，钙化组的大鼠血管组织中的APN以及adipo R1 mRNA 水平降低显著，分别降低了65.0%和72.0% (P<0.01，图1)。

2.3 钙化大鼠血管组织中adipo R1蛋白的变化 western blot结果显示，与对照组比较，钙化大鼠的血管组织中adipo R1蛋白降低了77.2%(图2)。

2.4 脂联素对钙化大鼠血管组织钙含量和碱性磷酸酶活性的影响 与对照组比较， 钙化的大鼠的血管组织中的钙含量和碱性磷酸酶活性分别增加6.55倍和83.4%(P<0.01)。给予脂联素的大鼠血管组织中钙含量和碱性磷酸酶活性分别降低68.5%和34.8% (P<0.01，表1)。

图1 钙化大鼠血管组织中脂联素APN与其受体adipo R1 mRNA含量的变化

图2 钙化大鼠血管组织中脂联素受体adipo R1 m蛋白含量的变化

±s；n=8)

注：①与对照组比较，P<0.01；②与钙化组比较，P<0.01

3 讨 论

APN、瘦素及抵抗素等生物活性物质是由脂肪组织分泌的，被统称为脂肪因子。其中，ANP是唯一被证明与代谢综合征、糖尿病及心血管疾病呈负相关的因子[5]。APN大量存在于血浆中， 在血浆总蛋白中所占比例达到 0.01%。以前认为，APN因子是脂肪组织所特异表达的。然而，最新研究显示，不但在白色的脂肪组织中有大量APN的表达，而且心肌及微血管内皮细胞也存在APN表达。adipoR1以及adipoR2为当前已经克隆的两种脂联素受体(adiponectin recepter,adipo R)，adipoR1在骨骼肌中大量表达，肝细胞是adipoR2的主要存在场所。

在衰老过程中、糖尿病、动脉硬化、高血压、肾病中普遍存在血管钙化，是这些疾病所共有的病理变化，极有可能造成心血管疾病。八成血管损伤及九成冠脉疾病患者都有不同程度的血管钙化[6]，但目前还没有关于脂联素及其受体在钙化血管组织发生变化过程和在血管钙化中它们所起作用的文献报道。本实验通过维生素D3的大剂量使用导致动脉组织增加了钙含量，而维生素D3的反应通过尼古丁的作用被增强，在两者的共同作用下，动脉组织出现钙超载，造成钙沉积于动脉中膜和弹力膜，血管组织最终发生钙化。结果显示，钙化大鼠的血浆和血管组织中APN的含量均有显著降低，钙化血管组织中APN与其受体adipoR1的mRNA表达水平明显减低，钙化组织中adipoR1的蛋白水平显著下降，提示在钙化血管组织中APN及其受体adipoR1系统均明显下调。

有文献[7]报道，APN通过多种信号通路，发挥抗炎、抗氧化、抗动脉粥样硬化、改善微循环及双向调节血管新生的功能，它具体的功能有在一氧化氮( NO )的生成中起促进作用； 对氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein ox-LDL)和高糖所诱导的活性氧(reactive oxygen species, ROS )的产生有抑制作用[8]； 肿瘤坏死因子-α( tumor necrosis factor, TNF-α)和高糖的作用下炎性反应信号的启动和传递起逆转作用[9]； 对内皮细胞和白细胞之间的作用相互抑制；对巨噬细胞活化及转化为泡沫细胞有抑制作用[10]；对血小板聚集起到抑制作用[11]。本实验给予钙化大鼠尾静脉注射APN 10 μg/次，每周2次，持续4周，结果发现，APN可明显抑制钙化大鼠血管组织的钙含量和碱性磷酸酶的活性，提示APN可以抑制维生素D3和尼古丁引起的大鼠血管钙化。APN可能通过影响血管钙化发病的多种调节因子，发挥其抗血管钙化的生物学效应，在抗血管钙化中的作用可能更复杂。就此进行深入探讨对预防在血管钙化疾病及逆转过程寻找或采取新治疗方法非常有利。

[1] Bostrom K. Insights into the mechanism of vascular calcification [J]. Am J Cardiol, 2001, 88 (2) : 20-22.

[2] 刘洪岩，谭洪勇，张金国. 脂联素在心血管疾病中的研究进展[J]. China Prac Med, 2009, 4(27): 229-232.

[3] 吴胜英, 张宝红, 蒋宏峰, 等. 血管钙化对血管组织内皮素表达的影响[J].中国动脉硬化杂志，2003, 11(4): 277-282.

[4] Liao Y, Takashima S, Maeda N,etal. Exacerbation of heart failure in adiponectin-deficient mice due to impaired regulation of AMPK and glucosemetabolism[J]. Cardiovasc Res,2005, 67(4): 705-713.

[5] Antoniades C, Antonopoulos A S, Tousoulis D,etal. Adiponectin: from obesity to cardiovascular disease[J]. Obes Rev, 2009, 10(3): 269-279.

[6] 张宝红, 杜军保, 唐朝枢. 血管钙化的调节机制[J]. 心血管病学进展,2003, 24(3) : 179-181.

[7] Cai X J, Chen L, Li L,etal. Adiponectin inhibits lipopolysaccharide-induced adventitial fibroblast migration and transition to myofibroblasts via AdipoR1-AMPK-iNOS pathway [J]. Mol Endocrinol, 2010, 24(1): 218-228.

[8] Tomizawa A, Hattori Y, Kasai K. Induction of gene expression in response to globular adiponectin in vascular endothelial cells[J].Life Sci, 2009, 85(11-12): 457-461.

[9] Zoico E, Garbin U, Olioso D,etal. The effects of adiponectin on interleukin-6 and MCP-1 secretion in lipopolysaccharide-treated 3T3-L1 adipocytes: role of the NF-kappaB pathway [J]. Int JMol Med, 2009, 24(6): 847-851.

[10] Bostrom K, Watson K E, Horn S,etal. Bone morphogenetic protein expression in human atherosclerotic lesions[J]. J Clin Invest, 1993, 91(4):1800-1809.

[11] Chen Y J, Zhang L Q, Wang G P,etal. Adiponectin inhibits tissue factor expression and enhances tissue factor pathway inhibitor expression in hum an endothelial cells[J]. Thromb Haemost,2008,100(2): 291-300.

(2015-03-10收稿 2015-05-20修回)

(责任编辑 岳建华)

Influence of adiponectin on vascular calcification in rats

YAN Liang1and WANG Kun2.

1. Medical Examination Center，302nd Hospital of PLA, Beijing 100039, China；2. Department of Medical Service，General Hospital of PLA, Beijing 100853,China

Objective To observe the changes of adiponectin and its receptors in vascular calcification, and the role of adiponectin on calcified tissues. Methods Male SD rats were induced vascular calcification by vitamin D3 and nicotine, with or without adiponectin. Calcium and alkaline phosphatase (ALP) were assayed. The levels of APN in plasma and vascules were measured by ELISA. The mRNA levels of APN and adipo R1 were detected by using real-time PCR, the level of adipo R1 protein was detected by Western blotting. Results Compared with control group, the APN concentrations in plasma and calcified blood vessels decreased by 47.1% and 57.1%, respectively. The mRNA levels of APN and adipo R1 decreased by 65.0% and 72.0%.The adipo R1 protein decreased by 77.2%(P<0.01). 6.55 fold increase calcium and 83.4% increase in ALP activity were observed in calcified blood vessels than that in control group, while APN treatment down-regulated the calcium and ALP activity by 68.5% and 34.8% (P<0.01). Conclusions In calcified blood vessels, the APN and adipo R1 system are down-regulated, and APN decreases the calcium and ALP activity, suggesting that APN may have cardiovascular protection by antagonizing calcification.

vascular calcification; adiponectin; adipo R1

闫 亮，本科学历，主管药师，E-mail:13717790466@163.com

1.100039 北京，解放军第302医院体检中心；2.100853 北京，解放军总医院医疗处

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