梅花鹿瘤胃液中棒状杆菌的分离鉴定与系统发育树的构建

刘晓颖，鲍坤，刘晗璐，李光玉，冯卓

(中国农业科学院特产研究所，长春 130112)

梅花鹿是我国鹿科动物中最为名贵的鹿种之一，与其它反刍动物一样，瘤胃与梅花鹿的健康以及生产性能密切相关，大量的细菌、真菌、原虫、噬菌体和产甲烷菌等微生物栖息在梅花鹿瘤胃内，而且这些微生物与微生物之间以及微生物与宿主之间处于一种相互制约、相互依赖的动态平衡状态，微生物通过相互间的协同作用，将采食的饲料物质转化为动物生长所需要的挥发性脂肪酸、氨基酸和维生素等营养物质[1]。由于瘤胃微生物的复杂性，目前，国内、外对反刍动物牛、羊瘤胃内细菌分离鉴定的研究较少，梅花鹿瘤胃内细菌研究基本为空白。

棒状杆菌为反刍动物瘤胃内正常存在的一种微生物，具有较强的耐受性和定植能力。本试验应用分离培养、革兰氏染色、显微镜观察、16Sr DNA序列分析与系统发育树构建相结合的方法，对18株来源于梅花鹿瘤胃的细菌进行分离鉴定与分子分类，丰富了瘤胃微生物资源数据库，并且为梅花鹿瘤胃细菌的利用研究提供技术基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1培养基及试验仪器厌氧琼脂培养基、营养琼脂等均按有关文献配制[2，3]；厌氧袋、厌氧产气袋(青岛海博生物公司)；细菌微量生化鉴定管(杭州天和生物有限公司)；细菌基因组提取试剂盒(天根生物工程公司)。

1.1.2瘤胃液采集[4]瘤胃液采自装有永久瘤胃瘘管的梅花鹿，无菌2层纱布过滤去掉残渣，滤液用无菌注射器注入厌氧培养管，4℃保温箱快速带回实验室。

1.2 方法

1.2.1菌种分离将4℃保存的瘤胃液样品取1mL，无菌操作10倍系列稀释到10-7倍，取0.1mL 10-6、10-72个梯度瘤胃液，分别涂布于营养琼脂培养基，37℃需氧和厌氧培养，待长出菌落，挑取边缘光滑、规则菌落接种于营养肉汤培养基中，培养18h～24h后，革兰氏染色镜检。

1.2.2耐氧实验将纯化的菌株分别接到MRS琼脂培养基和厌氧肉汤、营养肉汤培养基中，每株菌、每种培养基各2组，其中1组37℃需氧培养，另1组37℃厌氧袋培养，24h～48h观察结果。

1.2.3生理生化指标鉴定将上述分离的菌株进行触酶、糖类发酵等生理生化指标的测定。

1.2.4分离细菌16SrDNA序列测定分离纯化的细菌总DNA提取采用细菌基因组提取试剂盒并按操作说明书进行，凝胶电泳显示有DNA条带后，送测序，序列测定由吉林库美生物科技公司完成。所得序列利用EZTAXON软件在Ezbiocloud上进行同源性比较。

1.2.5分离菌株系统发育树的构建及分析选取同源性较高的典型菌株，将18株菌株与典型菌株序列利用MegA5.0软件构建系统发育树。

2 结果

2.1 细菌的初步分离筛选

在需氧和厌氧培养的营养琼脂培养基上，分别挑取形态规则、边缘整齐的灰白色菌落或黄色菌落，经革兰氏染色镜检观察，呈球杆状或梭杆状的革兰氏阳性菌。需氧培养灰白色菌落6株，分别为C1、C2、C3、C4、C5、C6；厌氧培养黄色菌落4株，分别为C7y、C8y 、C9y、C10y；厌氧培养灰白色或菌落8株，分别为C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18。分别接种于营养肉汤培养基中增菌。

2.2 耐氧实验

将“2.1”项下分离纯化的18株菌株接种于营养肉汤液体培养基增菌培养后，需氧和厌氧培养24h～48h观察发现，C11、C7y、C8y 、C9y、C10y在厌氧条件下生长浑浊，需氧条件下轻微浑浊，而其余13株菌在需氧、厌氧条件下均生长。

2.3 分离菌株的生理生化鉴定

分离的18株细菌触酶试验均为阳性，不能利用乳糖、甘露醇、阿拉伯糖、鼠李糖、山梨醇、纤维二糖，靛基质反应、苯丙氨酸反应阴性；除C4、C6外，均能利用葡萄糖、甘露糖、蔗糖、木糖、果糖，MR试验、硝酸盐还原试验阳性；C7y、C8y、C9y、C10y能利用麦芽糖、C7y可利用棉籽糖。具体生理生化鉴定结果见表1。

2.4 分离菌株特异性16Sr DNA的序列分析与系统发育树的构建[5，6]

对18株分离纯化的细菌做了16Sr DNA序列测定。18株细菌16Sr DNA序列长度约为1400bp，与Ezbiocloud上进行EZTAXON序列比对，C1、 C2、C3、C5、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18与CorynebacteriumvitaeruminisDSM 20294(CP004353)序列同源性达99.93%以上，C4、C6与C.glycinophilumAJ3170(CP006842)同源性99.71%以上，C11与C.minutissimumATCC 23348同源性96.66%，C7y、C8y、C9y、C10y与C.minutissimumATCC 23348同源性96.83%以上，结合菌株革兰氏染色阳性、菌落形态特征、生理生化特征，最后确定分离得到的菌株均为放线菌纲放线菌目棒状杆菌科棒状杆菌属细菌。将18株菌株的16Sr DNA序列与C.vitaeruminisDSM 20294(CP004353)、C.minutissimumATCC 23348(JSEF 01000027.1)、C.glycinophilumAJ3170(CP006842)3株同源性较高的菌株在Genebank上的序列比对，利用MeGA5.0软件构建系统发育树，如图1所示。C1、C2、C3、C5、C12、C13、C14、C16、C17、C18与C4、C6亲缘关系较近，C11与C7y、C8y 、C9y、C10y亲缘关系较近。

表118株梅花鹿瘤胃分离细菌的生理生化特性

Table118StrainsofbacteriaisolatedfromtherumenofSikadeerphysiologicalandbiochemicalcharacteristics

3 结论

本试验利用普通琼脂平板培养基，通过需氧和厌氧2种培养方式，从梅花鹿瘤胃液内分离出18株细菌，菌落颜色呈灰白色需氧菌6株，分别为C1、C2、C3、C4、C5、C6；菌落颜色呈黄色的厌氧菌4株，分别为C7y、C8y 、C9y、C10y；菌落颜色呈灰白色厌氧菌8株，分别为C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18。革兰氏染色镜检，菌体为球杆状或梭杆状的革兰氏阳性细菌；耐氧实验表明，除C11、C7y、C8y、C9y、C10y在需氧条件下长势较差外，其余菌株在厌氧条件下均生长良好。

对分离的18株细菌进行部分生化鉴定，18株细菌触酶试验均为阳性，不能利用乳糖、甘露醇、阿拉伯糖、鼠李糖、山梨醇、纤维二糖，靛基质反应、苯丙氨酸反应阴性；除C4、C6外，均能利用葡萄糖、甘露糖、蔗糖、木糖、果糖，MR试验、硝酸盐还原试验阳性；C7y、C8y、C9y、C10y能利用麦芽糖，C7y可利用棉籽糖。

由于细菌在培养基上的菌落形态差别很小，细菌的多形性仅仅通过菌落形态、染色特性和生理生化鉴定并不能准确说明是哪种细菌，18株分离菌在营养琼脂培养基上生长的菌落颜色形态、镜下形状并不相同，为此，本实验提取了纯化细菌的基因组DNA，

图1 分离的18株细菌的系统发育树

对分离的18株细菌进行了16Sr DNA的测序，并进行了同源性分析，将18株菌株的16Sr DNA序列与3株同源性较高的菌株Genebank上的序列进行对比，利用MeGA5.0软件构建系统发育树，结合菌落形态和生理生化指标，确定分离的18株梅花鹿瘤胃细菌为放线菌纲放线菌目棒状杆菌科棒状杆菌属细菌。

[1]黄青云.畜牧微生物学[M].北京:中国农业出版社,2004.

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