散沫花叶总黄酮、多酚含量测定及体外抗氧化活性研究

姜洪芳, 石宝俊， 张锋伦， 陈 蕾, 施国新, 张卫明*

(1.南京野生植物综合利用研究院,江苏 南京 210042； 2.南京师范大学, 江苏 南京 210046)

散沫花叶总黄酮、多酚含量测定及体外抗氧化活性研究

姜洪芳1,2, 石宝俊1， 张锋伦1， 陈 蕾1, 施国新2*, 张卫明1,2*

(1.南京野生植物综合利用研究院,江苏 南京 210042； 2.南京师范大学, 江苏 南京 210046)

用55%乙醇回流提取散沫花叶中的活性物质，采用比色法测定提取物中的总黄酮及多酚含量，测定了其对DPPH、羟自由基、超氧阴离子自由基的清除能力和还原力等抗氧化活性指标。结果表明，散沫花叶提取物中的总黄酮(以芦丁计)、多酚(以没食子酸计)含量分别为39.42 mg/g、 116.20 mg/g，提取物具有一定的抗氧化活性，且抗氧化活性与提取物浓度存在量效关系，本研究为散沫花叶作为低毒高效的天然抗氧化剂应用提供了依据。

散沫花叶；提取物；总黄酮；多酚；抗氧化活性

散沫花(LawsoniainermisLinn.)为千屈菜科散沫花属多年生灌木，原产于热带、亚热带地区，广泛分布于中东、北非，印度西部、巴基斯坦、摩洛哥、也门、伊朗、苏丹及利比亚是其商业栽培的的重要产地，我国广东、广西、江苏、浙江、云南、福建、台湾等省也有栽培，其叶、花、果实、种子都可以作为传统中药使用，是维吾尔医常用药材之一，收载于卫生部颁标准维药分册，以叶入药，是一种很有利用价值的植物，叶可制成红色染料，用于染发护发，是最早用来染发的植物染发剂之一；古代阿拉伯人用其树皮治黄疽病及精神病；叶捣碎外敷有止痛、消肿、化脓的功效；种子提取物对大脑有缓慢的兴奋作用，可用于记忆力差或全身精神功能不足的治疗。现代研究发现散沫花含有醌、苯丙素、黄酮、三萜、酚酸和脂肪酸等多种类型的化合物，并具有抗菌、抗肿瘤、抗氧化、抗寄生虫等广泛的药理活性，有很大的开发利用价值[1-4]。

本研究以散沫花叶为原料，采用55% 的乙醇回流提取其抗氧化活性物质，然后测定总黄酮及多酚的含量，采用常用的4种体外抗氧化体系，测定提取物对DPPH、羟自由基、超氧阴离子自由基的清除能力和还原力等抗氧化活性指标。结果表明，散沫花叶提取物总黄酮及多酚含量分别为：39.42 mg/g、 116.20 mg/g ，具有较强的抗氧化活性，可能是一个有价值的生物活性资源。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

T6紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司);恒温水浴锅、分析天平(METTLER)、离心沉淀机(上海手术器材厂);旋转蒸发仪(上海亚荣仪器厂)。

没食子酸、芦丁均购于中国生物制品检定研究院，批号110831-201303、100080-201202。

抗坏血酸(即Vc)，三氯化铝、福林酚(Folin-Ciocalteu)试剂、无水碳酸钠、DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、过氧化氢、邻苯三酚(焦性没食子酸)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、盐酸、三氯乙酸、磷酸二氢钠 、磷酸氢二钠、三氯化铁、水杨酸、硫酸亚铁、铁氰化钾为市售分析纯。

0.5 mmol/L DPPH甲醇溶液:准确称取DPPH固体粉末0.049 5 g，在烧杯中用少量甲醇溶解，定容至250 mL容量瓶中，配制成0.5 mmol/L DPPH甲醇溶液。

10 mmol/L硫酸亚铁溶液：精密称取0.347 5 g硫酸亚铁，溶于250 mL蒸馏水中，即得10 mmol/L硫酸亚铁溶液。

10 mmol/L水杨酸乙醇溶液：精密称取0.417 5 g水杨酸，溶于250 mL乙醇中，即得10 mmol/L水杨酸乙醇溶液。

2.5 mmol/L H2O2溶液：精密量取0.13 mL H2O2溶液(体积分数为30%)，加蒸馏水稀释，并定容至500 mL,即得2.5 mmol/L H2O2溶液。

0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH=8.2)的配制：精密称取1.211 g 三羟甲基氨基甲烷(Tris),溶于蒸馏水中定容至100 mL；量取50.00 mL上述溶液与0.1 mol/L盐酸22.90 mL混匀后，加水稀释至100 mL，所得缓冲液pH值为8.2。

盐酸溶液的配制：精密量取0.8 mL的浓盐酸，加蒸馏水稀释至100 mL,即得0.1 mol/L盐酸溶液；精密量取0.85 mL浓盐酸，加水稀释至1 000 mL，即得10 mmol/L盐酸溶液。

25 mmol/L邻苯三酚溶液的配制：精密称取0.3150 g 邻苯三酚，用10 mmol/L盐酸溶解，定容至100 mL，即得25 mmol/L邻苯三酚溶液。

pH6.6磷酸缓冲液的配制：分别精密称取磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和氯化钠1.740 0 g、2.700 0 g、1.700 0 g，溶于400 mL蒸馏水中，即得pH6.6磷酸缓冲液。

1%铁氰化钾溶液的配制：精密称取1.000 0 g铁氰化钾，溶于100 mL蒸馏水中，即得1%铁氰化钾溶液。

10%三氯乙酸溶液的配制：精密称取10.000 0 g三氯乙酸，溶于100 mL蒸馏水中，即得10%三氯乙酸溶液。

0.1%三氯化铁溶液的配制：精密称取0.170 0 g六水合氯化铁，溶于100 mL蒸馏水中，即得0.1%三氯化铁溶液。

散沫花的叶于2013年4月采自江苏，晾干，经鉴定其基原为LawsoniainermisLinn.。

1.2 实验方法

1.2.1 提取物的制备

称取50 g已粉碎的散沫花的叶，加入55% 乙醇750 mL，回流提取2 h，过滤，滤渣加入55% 乙醇600 mL混匀，再次回流提取2 h，过滤，合并两次滤液，70 ℃减压蒸干，备用。

1.2.2 总黄酮、多酚含量测定[5-6]

1.2.2.1 总黄酮标准曲线的绘制 精密称定0.042 01 g芦丁，用甲醇溶解定容至10 mL，得4.201 mg/mL芦丁标准溶液。分别移取0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10 mL到10 mL具塞试管中，加入1% AlCl3溶液5.00 mL，混匀，室温静置30 min，于435 nm处测定吸光度值，以芦丁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，求线性回归方程。

1.2.2.2 多酚标准曲线的绘制 精密称定0.100 1 g没食子酸，用蒸馏水溶解定容至100 mL，得1.001 mg/mL没食子酸标准溶液。分别移取0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mL至50 mL容量瓶中，加入25 mL蒸馏水，加入2.00 mL Folin-Ciocalteu试剂摇匀，静置4～5 min，加入10% Na2CO3溶液4.00 mL，用蒸馏水定容至50 mL，置于25 ℃的恒温水浴锅中显色2 h，于最大吸收波长765 nm处测定各个标准溶液吸光度，以没食子酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐，标绘制标准曲线，求线性回归方程。

1.2.2.3 散沫花提取物总黄酮、多酚测定 准确称取散沫花叶提取物0.100 0 g，溶于100 mL 65%乙醇中，得1.000 mg/mL样品液，准确吸取0.10 mL提取液按1.2.2.1、1.2.2.2进行显色反应，按照回归方程计算测定液中总黄酮、多酚浓度，并计算出提取物中总黄酮、多酚的含量。

1.2.3 散沫花叶提取物抗氧化活性测定

准确称取散沫花叶提取物和对照品各0.100 0 g，溶于100 mL 65% 乙醇中，得1.000 mg/mL母液，并分别稀释，配制成0.10、0.25、0.50、0.75、1.00 mg/mL的提取物及对照品溶液，供抗氧化活性测定用。

1.2.3.1 对DPPH自由基清除活性的测定[7]分别移取不同浓度的样品及对照品溶液各2.00 mL，加入0.5 mM DPPH甲醇溶液2.00 mL，混匀15 s后，放置30 min，以2 .00 mL不同浓度样品或对照品溶液加入2.00 mL甲醇为参比，于517 nm测吸光度，记为A1，每个试样作三次平行测定，取其均值，同时移取2.00 mL 65% 乙醇加入2.00 mL 0.5 mmol/L DPPH甲醇溶液，混匀15 s后，放置30 min，以2.00 mL 65% 乙醇加入2.00 mL甲醇为参比，于517 nm测吸光度，记为A0，并根据下述公式计算清除率。

1.2.3.2 对羟自由基清除活性的测定 采用改良的Smirnoff水杨酸法[8]，即利用H2O2与Fe2+反应产生羟自由基，即：H2O2+Fe2+→·OH+H2O+Fe3+，在体系内加入水杨酸捕捉并产生有色物质，该物质在510 nm处有最大吸收。

样品溶液的测定：分别准确量取10 mmol/L硫酸亚铁溶液、10 mmol/L水杨酸乙醇溶液和不同浓度的样品溶液各1.00 mL，置于具塞试管中混匀，分别加入2.5 mmol/L H2O2溶液2.00 mL， 37 ℃水浴30 min后，分别在510 nm处测定吸光度值。每个试样作3次平行测定，取其均值为A1，另外参照上述操作分别测定相应的吸光度值A0和A2，按下式计算羟自由基清除率：

其中：A0为反应体系中不含样品，即以1mL 65%乙醇代替样品的吸光度值；A1为反应体系中含有样品的吸光度值；A2为反应体系中含有样品,但以2.00 mL蒸馏水代替H2O2的吸光度值。

1.2.3.3 对超氧阴离子自由基清除活性的测定 采用邻苯三酚自氧化法测定样品对超氧阴离子自由基的清除能力[9]。

样品溶液的测定：精密量取0.05 mmol/L Tris-HCL缓冲液4.50 mL，25 ℃水浴20 min，分别加入1.00 mL不同浓度的各样品溶液和25 mmol/L邻苯三酚溶液0.40 mL,混匀，于25 ℃水浴中反应5 min，加入10 mmol/L盐酸溶液1.00 mL终止反应，于325 nm处测定吸光度。每个试样作3次平行测定，取其均值为A1。另外参照上述操作分别测定相应的吸光度值A0和A2，按下式计算超氧阴离子清除率：

其中：A0为反应体系中不含样品，但含邻苯三酚的吸光度值；A1为反应体系中既含样品，又含邻苯三酚的吸光度值；A2为反应体系中含有样品，但不含邻苯三酚的吸光度值。

1.2.3.4 散沫花提取物还原力的测定 参考Oyaizu和Amarowicz等的方法，稍作改进[10]。

样品溶液的测定：

精密量取不同浓度的样品溶液2.50 mL于试管中，依次加入2.50 mL磷酸缓冲液(pH值为6.6)和1% 铁氰化钾溶液2.50 mL，于50 ℃水浴保温20 min，快速冷却，再加入10% 三氯乙酸2.50 mL，以3000 r/min离心10 min，取上清液2.50 mL，依次加入2.00 mL蒸馏水， 0.1% 的三氯化铁溶液0.50 mL，充分混匀，静置10 min后，于700 nm处测吸光度值，吸光值越大表示还原力越强(以蒸馏水作对比)。每个试样作3次平行测定，取其平均值。

2 结果与讨论

2.1 散沫花乙醇提取物的提取率、总黄酮及多酚含量

从表1中可以看出，散沫花乙醇提取物的得率为33.26%，通过应用总黄酮线性回归方程：y=19.17x-0.503 3(R2=0.993 3)及多酚线性回归方程：y=0.108 5x-0.027 9(R2=0.995 5)，计算出散沫花醇提取物中的总黄酮含量(以芦丁计)及多酚含量(以没食子酸计)，见表1。

表1 散沫花乙醇提取率和总黄酮、多酚含量

2.2 散沫花提取物抗氧化活性比较

2.2.1 对DPPH自由基清除活性的测定结果

DPPH法自1958年被提出后，广泛地用于各种生物试样和食品的抗氧化能力测定。DPPH是一种比较稳定的脂性自由基，其N上有一个游离电子，其乙醇溶液呈紫色，在517 nm处有最大的吸收峰。加入抗氧化剂以后，DPPH捕捉一个电子与游离电子配对，紫色褪去，在517 nm处的吸收变弱，其褪色程度与其接受的电子数成定量关系。依此原理用分光光度计检测DPPH自由基与样品液反应后吸光值的变化，可测定样品提供氢原子、清除自由基抗氧化的能力。

图1 散沫花提取物对DPPH清除活性

散沫花乙醇提取物对DPPH清除率的分析如图1所示，在此实验中，以Vc为对照，在试验浓度范围内，随着浓度的升高，Vc及样品对DPPH自由基的清除率都呈现增长的趋势，且 Vc对DPPH清除能力大于散沫花提取物。当浓度达到1.00 mg/mL时，Vc对DPPH自由基的清除率高达98.03%，散沫花提取物对DPPH自由基也具有较好的清除能力，清除率为90.63%。

2.2.2 对超氧阴离子自由基清除活性的测定结果

超氧阴离子是由氧分子接收一个电子而形成的，同生物体内其它活性氧自由基的产生有密切联系。超氧阴离子在生物体内可长时间攻击靶向目标，破坏细胞DNA，损伤人类机体功能。可用于模拟细胞内产生及清除的体系有很多，但较为常用的是邻苯三酚法。利用邻苯三酚在碱性环境中发生自氧化链式反应并释放出大量的超氧阴离子，超氧阴离子又进一步加速邻苯三酚的氧化，生成一系列在可见光区有特征吸收的中间产物。而若在反应体系中加入抗氧化物质可降低邻苯三酚的自氧化速率，清除产生的超氧阴离子，抑制中间产物的生成，使反应溶液在325 nm处的吸光度减小。通过比较实验组与空白组邻苯三酚的自氧化速率评价样品的抗氧化能力。

以Vc为对照，测定散沫花提取物清除超氧阴离子的能力，结果如图2所示。从图中可以看出，在试验所测定浓度范围内，各样品对超氧阴离子自由基的清除率都随着浓度的升高而升高,总的趋势为Vc对超氧阴离子清除能力高于散沫花提取物。在浓度达到0.75 mg/mL时，Vc对超氧阴离子自由基的清除率已经达到100%，散沫花醇提取物对超氧阴离子自由基的清除率虽然有所升高，但趋势较为缓慢，在1.00 mg/mL的浓度时，其抑制率不到50%，因此散沫花醇提物对超氧阴离子自由基具有一定的清除作用，但是较弱。

图2 散沫花提取物对超氧阴离子自由基的清除活性

2.2.3 散沫花醇提取物对羟自由基清除活性的测定

人体在生命活动氧化代谢过程中会产生各种各样的自由基，而羟自由基能够和多肽、蛋白、脂类、DNA，特别是鸟嘌呤核苷等发生反应，使得不饱和脂肪酸氧化，生成脂质过氧化物，导致膜结构遭到破坏，从而使机体受到损伤与破坏，加快机体的衰老，引起脑缺血、帕金森氏症、风湿性关节炎、呼吸窘迫综合症、心血管疾病和癌症等疾病，是化学性质最活泼、对机体危害最大的自由基。本试验采用水杨酸法测定样品对羟自由基的清除能力，水杨酸是最常用的捕获剂，其羟基化产物是2,3-以及2,5-二羟基苯甲酸。过氧化氢和硫酸亚铁溶液中的二价铁离子发生Fenton反应产生羟自由基，用水杨酸捕捉高活性的羟自由基可产生有色物质，且该有色物质在510 nm处有最大吸收，若向反应体系里加入抗氧化剂，可以和水杨酸形成竞争从而减少有色物质生成。因此本试验通过分光光度计对有色物质的吸光度进行测定达到间接测定自由基的目的，进而反应氧化应激水平。

图3 散沫花提取物对羟自由基的清除活性

从图3可以看出，在试验浓度范围内，随着浓度的增大，Vc对羟自由基的清除率上升较快，散沫花提取物对羟自由基的清除率有缓慢的升高。当浓度在0.1 mg/mL左右时，散沫花提取物的清除能力均高于Vc；当浓度达到0.25 mg/mL时，散沫花提取物对羟自由基的清除率达到59.13%，稍高于Vc(清除率为58.14%)；当浓度达到1 mg/mL时，散沫花提取物对羟自由基清除率达到83.62%，具有较强的清除作用。

2.2.4 还原力测定

一种物质的还原能力可以在一定程度上反应它潜在的抗氧化活性，通过给自由基提供电子而自身得到一个质子，使自由基失活。通常来说，物质的还原力越强，就表示其抗氧化活性越强。还原力测定的实质就是检测待测样品能否成为好的电子供应者。本试验以普鲁士蓝的生成作为检测指标，待测样品将Fe3+/铁氰化物还原为Fe2+/铁氰化物，反应体系溶液变为不同程度的蓝色，其在700 nm处有特征光吸收，吸光度大小反应待测样品的抗氧化活性。

图4 散沫花提取物还原力测定

由图4可以看出，在试验浓度范围内， Vc还原力随着浓度的增加而明显增大，在浓度为0.25 mg/mL时，其还原能力达到1.4；散沫花提取物的还原力与浓度存在量效关系，但还原能力一般，在浓度为1 mg/mL时，还原力为2.395，稍弱于Vc。

3 结 论

3.1 采用55%乙醇回流提取散沫花中的活性物质，提取率为33.26%，提取物中总黄酮的含量为39.42 mg/g，多酚的含量为116.20 mg/g。用同法提取了另外一种染指甲的凤仙科植物凤仙花((ImpatiensbalsaminaL.)的叶、花，提取物中总黄酮含量为112.13、108.06 mg/g，多酚含量为72.81、66.07 mg/g。散沫花与凤仙花的原植物科属不同，前者属于千屈菜科，后者属于凤仙花科。其药用部位也不同，前者用其叶，后者用其花。实验表明凤仙花的叶及花中的总黄酮约是散沫花叶的3倍，而散沫花叶所含的多酚类物质约是凤仙花叶及花的2倍，说明二者的化学物质基础具有一定的差别，在实际应用要注意区分。

3.2 目前，没有一种普遍通用的方法就能较为准确地定量测定某样品的抗氧化能力，因此在评价某样品抗氧化活性时，通常采用几种不同的检测方法。本文采用了DPPH自由基清除能力测定、羟自由基清除能力测定、超氧阴离子清除能力测定和还原能力测定，以Vc为对照，结果表明，散沫花提取物均有不同程度的抗氧化活性，且抗氧化能力与浓度呈量效关系；综合各个检测方法，散沫花提取物具有较强的清除DPPH、羟自由基清除活性和还原力，且与对照组Vc相近，都有剂量依赖性。

3.3 样品的抗氧化活性与总黄酮、多酚含量之间存在一定的相关性。虽然未对其相关性作定量测定，但实验结果表明，散沫花提取物的抗氧化活性与多酚含量更为密切。

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Determination of Total Flavonoids and Phenolic Contentand Antioxidant Activities of Ethanol Extract from theLeaves ofLawsoniainermisLinn.

Jiang Hongfang1,2, Shi Baojun1, Zhang Fenglun1, Chen Lei1, Shi Guoxin2*, Zhang Weiming1,2*

(1.Nanjing Institute for Comprehensive Utilization of Wild Plants, Nanjing 210042, China; 2.Life Science Institute of Nanjing Normal University, Nanjing 210046， China)

The aim of this study was to investigate the contents of total flavonoid and phenolic, and antioxidant activity of 55% ethanolic extract from the leaves ofLawsoniainermisLinn.. The results revealed that the total flavonoid and phenolic contents of the extract were 39.42 mg/g Rutin extract and 116.20 mg/g Galic acid extract.Leaf extracts exhibited the highest activity in removing DPPH free radicals,hydroxyl free radicals and superoxide anion as well as the highest reducing capacity.From these results, the extract fromL.inermismight be a valuable bioactive resource.

LawsoniainermisLinn; flavonoid; phenolic; antioxidant activity

2015-02-21

国家“十二五”科技支撑计划(2012BAD36B01)。

姜洪芳(1974—),女,博士研究生,副研究员,主要研究天然产物活性物质应用与开发。E-mail:jhf74@163.com

*通讯作者： 张卫明,男,研究员,从事植物活性物质的应用与开发。E-mail: botanyzh@163.com 施国新,男,教授,从事重金属对植物生理生化影响研究。E-mail:gxsh@njnu.edu.cn

10.3969/j.issn.1006-9690.2015.05.003

R284

A

1006-9690(2015)05-0009-05