番茄黄化曲叶病毒病研究进展

孙 胜，亢秀萍，邢国明，邢晓娟，许小勇，张 毅，张 静，王 雁，郑少文，聂红玫

（山西农业大学园艺学院，山西 太谷 030801）

番茄黄化曲叶病毒病研究进展

孙 胜，亢秀萍，邢国明*，邢晓娟，许小勇，张 毅，张 静，王 雁，郑少文，聂红玫

（山西农业大学园艺学院，山西 太谷 030801）

论文从研究现状、植株症状、致病机理、检测方法、防治措施、抗病育种方法、鉴定手段等多方面阐述番茄黄化曲叶病毒病研究进展，对番茄黄化曲叶病毒病研究方向、防治工作等提出展望。

番茄黄化曲叶病毒；致病机理；抗病育种；抗性鉴定

网络出版时间2015-4-30 14:43:00 [URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20150430.1443.010.html

孙胜,亢秀萍,邢国明,等.番茄黄化曲叶病毒病研究进展[J].东北农业大学学报,2015,46(5):102-108.

Sun Sheng,Kang Xiuping,Xing Guoming,et al.Research progress on the tomato yellow leaf curl virus disease[J].Journal of Northeast Agricultural University,2015,46(5):102-108.(in Chinese with English abstract)

番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）病20世纪30年代末在以色列首次发现；Cohen与Harpaz研究认为烟粉虱是传播TYLCV媒介，并将其命名为TYLCV病[1]；90年代末亚洲各国相继发现该病毒病。1991年我国首次在广西南宁发现该病毒。2006年起该病毒传播到北京、山西、江苏、上海、广东、广西、云南等地，对番茄产业造成严重影响[2]。

番茄植株感染TYLCV后的症状与病毒分离物、寄主遗传背景、环境条件及不同侵染时间有关。一般情况下都会发现顶部叶片边缘上卷、叶片皱缩卷曲、叶片黄化等症状。表现症状随发病和感病时间不同而不同。TYLCV病初期发病症状主要表现为植株上部叶片变小，顶端叶片边缘轻微黄化且上卷，叶脉间叶肉发黄，整个叶片萎缩、褶皱，植株生长变缓或停滞，节间缩短，明显矮化；后期发病症状主要表现为叶脉变紫，叶片变形焦枯，新叶出现黄绿不均斑块，有凹凸不平的皱缩或变形，严重时叶片萎缩，开花后不结果或多畸形果，果实成熟慢，产量和质量品质降低[2]。番茄黄化曲叶病毒病危害范围广，已受到广泛关注。本文对番茄黄化曲叶病植株症状、致病机理、检测方法、防治措施、抗病育种方法、鉴定手段等进行全面阐述，以期进一步明确番茄黄化曲叶病毒病的研究方向和热点，为科研选题提供依据。

1 番茄黄化曲叶病致病机理

1.1 番茄黄化曲叶病毒病病原

TYLCV属于双生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花叶病毒属（Begomo virus），是植物病毒中唯一一类具有孪生颗粒形态的单链环状DNA（Single stranded DNA，ssDNA）病毒[3]。该病毒传播媒介为烟粉虱，因此也被称为烟粉虱传双生病毒（Whiteflytransmitted geminiviruses,WTG），可侵染茄科、豆科等20多种植物。

1.2 番茄黄化曲叶病毒传播途径

TYLCV在自然状态下由烟粉虱进行传播。该虫寄主范围广泛，通过取食获毒且传毒持久，获毒饲育时间一般为0.5～1 h后即可传毒。如果获毒饲育时间长达1～2 d，则传毒效率更高。一旦获得毒性，就可连续传毒10～20 d。TYLCV在烟粉虱体内潜伏期为1 d，Zrachya等研究表明，TYLCV可以在烟粉虱体内增殖，通过交配传递给其交配对象，或传给后代[4]。寄主在被侵染后1～2周可表现出症状。烟粉虱对TYLCV传毒效率除随其获毒及传毒时间延长、传毒烟粉虱个体数量增加及病毒体浓度增加而提高外，还与烟粉虱龄期及性别有关。TYLCV与烟粉虱互作关系复杂对烟粉虱携带TYLCV种类及传毒可能性产生影响。不同烟粉虱种类对不同病毒种类的传播效率不同，导致病毒流行种类将与烟粉虱种类密切相关。TYLCV发病程度主要取决于番茄育苗期间烟粉虱危害程度，烟粉虱暴发后不久，其所传播病毒病会发生流行。

1.3 番茄黄化曲叶病毒基因组结构及功能基因

TYLCV基因组是单链闭合环状ssDNA分子，也称为DNA-A。TYLCV基因组编码6个功能基因：正义链上的AV1和AV2与反义链上的AC1、AC2、AC3和AC4[5]。AV1编码外壳蛋白（Coat pro⁃tein,CP），通常与病毒的包壳及介体传播有关[6]；AV2编码移动蛋白（Move protein,MP）相关的蛋白，其主要起到协助移动蛋白的功能[7]；AC1编码复制相关蛋白（Replication-associated protein,Rep），其与TYLCV DNA的复制起始有关[8]；AC2编码转录激活因子（Transcriptional activator，TrA），能提高正义链上的功能基因转录水平[9]；AC3编码复制增强蛋白（Replication enhancer protein,REn），但与AV1功能无关[10]；AC4基因功能尚未明确[11]。TYL⁃CV核穿梭功能是由AV1蛋白完成，而胞间移动需要AV1和其他蛋白共同参与作用[12]。

1.4 番茄黄化曲叶病毒的侵染过程

TYLCV经由烟粉虱侵染植物表皮细胞，经细胞内转运进入细胞核。TYLCV DNA在细胞核中开始复制、转录和翻译，新合成DNA和外壳蛋白组装成子代病毒。新合成病毒通过胞质通道或胞间连丝扩展到相邻细胞，达到系统侵染目的[13]。在虫媒取食后又传播到其他植物，开始新的侵染循环。

1.4.1 TYLCV移动

带毒烟粉虱取食寄主植物细胞汁液同时，将TYLCV注入到寄主细胞，病毒基因组脱壳，然后由CP包裹ssDNA，形成CP:ssDNA复合物，顺利进入细胞核开始基因的复制和转录[14]。CP和新合成的ssDNA再次形成复合物，将ssDNA从细胞核中输出，与细胞质中Pre-CP形成Pre-CP:CP:ssDNA复合物。该复合物通过胞间连丝把ssDNA转运到相邻细胞，开始新一轮侵染。Dry等研究表明病毒CP通常决定于基因组DNA大小，CP能包裹的ssD⁃NA分子大小为全长基因组1/4到全长[15]。烟粉虱传染病毒专一性由病毒的AV1基因决定[16]。

1.4.2 TYLCV复制

TYLCV在寄主植物体内复制方式为滚环复制（Rolling circle replication,RCR）[17]。其过程分为两个阶段：

①病毒在依赖寄主植物细胞DNA合成酶系条件下，以（+）链为模板合成（-）链，产生复制中间体dsDNA。（-）链的合成首先以RNA为引物，当合成延伸快到引物时，引物迅速被切除，（-）链进一步合成形成完整的环状dsDNA[18]；

②以环状dsDNA为模板合成（+）链，通过AC1蛋白识别并切割茎环结构，露出复制起始位点，当（+）链合成时，母链脱环产生ssDNA。（+）链合成完成时，AC1蛋白再次修饰合成的片段并将其环化。（+）链在其复制和延伸过程中所需蛋白辅助因子尚未明确。Gorbalenya等研究发现AC1蛋白序列与DNA解旋酶序列有部分同源性，因而预测AC1蛋白可能具有解旋酶功能[19]。此外，AC3蛋白能够激活并增强病毒复制功能，也称为复制增强蛋白。

1.4.3 TYLCV转录

TYLCV转录为双向转录，因此转录出的mRNA有（+）链与（-）链之分。TYLCV转录起始于IR区内，poly（A）终止信号位于IR区对面。转录出mRNA分子多为复合重叠的RNA，转录产物多为多顺反子。TYLCV在寄主植物细胞核内进行转录，可能是依赖寄主植物细胞的RNA PolymeraseⅡ系统。

TYLCV转录分为两个阶段：早期转录和晚期转录。早期转录的是AC1和AC2以及参与DNA复制和转录的相关蛋白基因；晚期主要转录AV1基因，参与DNA装配。早晚期的过渡通过AC1和AC2蛋白互作调节。ACl蛋白可快速寻找到复制起点并启动复制，同时抑制AV1等晚期基因复制与转录[20]。AC2蛋白则与AC1蛋白相反，可以在转录水平上增强AV1等晚期基因表达[21]。此外，TYLCV基因组中晚期保守因子（CLE）可以与AC2相互作用，激活（+）链转录[22]。AC3蛋白不但能增强复制，而且能增强启动子活性，功能可能与其N末端氨基酸序列含有的转录激活域相关。

2 TYLCV病检测方法

建立一套完整和灵敏的检测鉴定技术指标体系，对于TYLCV病的防治和抗病品种育种具有重要理论和实践意义。常见检测鉴定技术主要有目测法、酶联免疫吸附法、PCR法、核酸杂交法及滚环扩增法等。

2.1 目测法

目测法是通过观察感病植株症状判断是否感染病毒。目测观察检测主要缺点是凭借经验判断，检测结果与检测者主观性或外界环境影响有关[23]，并需结合分子生物学或免疫学方法检测确定是否染毒。

2.2 酶联免疫吸附(ELISA)法

ELISA法是一种建立在免疫学基础上，利用抗原抗体特异性反应检测。该方法以不同的TYLCV作为抗原，利用抗原抗体的免疫学反应结合酶催化反应的检测法[24]。主要优点是酶高效性，可利用级联性放大试验效果。生产中常用三抗体夹心ELISA（TAS-ELISA）检测法。这种方法简单快捷，但存在不足：检测TYLCV单克隆抗体制备过程较复杂、存在假阳性、特异性强，只能检测单个病毒，很难区分同一地区不同病毒小种，需要特殊仪器辅助。

2.3 聚合酶链式反应(PCR)法

PCR法已被用于多种TYLCV灵敏检测，是利用设计的简并或特异性引物，通过PCR检测TYL⁃CV方法。特异性引物只能专一检测特定病毒，而简并引物则可以同时检测出多种病毒。该方法灵敏度较高，在感病初期时即可检测。PCR法除具有高灵敏度和强特异性外，由于使用仪器简单，被广泛用于实验室检测。Zhang等使用该方法鉴定上海地区TYLCV[25]。有时番茄植株同时感染多种病毒，为提高检测效率，引进多重PCR，可检测出多种病毒。Lefeuvre等利用多重PCR法鉴定TYL⁃CV和TYLCV-Mld[26]。

2.4 核酸杂交技术

核酸杂交是一种基于病毒核酸链之间互补碱基对特异性结合检测TYLCV技术。该技术基本原理为设计带有标记探针，利用探针与TYLCV形成双链中间体，检测出样本中TYLCV。该技术目前已广泛应用于TYLCV检测、TYLCV鉴定以及抗TYLCV育种。对于探针标记，放射性同位素标记探针灵敏度高于非放射性探针[27]。近年来使用非放射性同位素标记作为探针较多，主要有生物素、地高辛和荧光素。

2.5 滚环扩增法

由于TYLCV在植物中浓度低，常规ELISA检测难度较大。TYLCV DNA重组概率高，PCR法难成功检测。因此，滚环扩增法成为近年TYLCV检测常用方法。该方法能快速扩增指定DNA，可放大TYLCV信号。目前已广泛应用于研发各类TYL⁃CV种类鉴定试剂盒[28]。余玲玲等将双生病毒信号放大，结合RFLP技术对不同类型双生病毒及田间样品进行比较，研究发现试验结果与PCR法检测结果一致[29]。

3 TYLCV病的防治

TYLCV现已成为多个国家和地区番茄生产上的重要限制因素。预防为主、防治结合是目前防治番茄黄化曲叶病毒病主要原则。实践表明：仅靠单一方法难以防治该病害，因此需要采用综合防治措施，目前主要通过以下四种措施对该病进行综合防治。

3.1 调整栽培结构

TYLCV病发病区不种植易传病的茄科蔬菜；可以在TYLCV病发病区种植烟粉虱不喜食的韭菜和葱蒜类作物；避免在烟粉虱高发阶段种植番茄，减少TYLCV侵染。尹贤贵研究发现，番茄和玉米间作，能延迟病毒传播，但不抗病毒[30]。

3.2 防治烟粉虱

TYLCV主要通过烟粉虱传播，在生产中可采用以南瓜为诱饵、用防虫网阻隔烟粉虱或喷施杀虫剂等方法加以综合防治[31]。药剂防治可有效控制TYLCV传播，但会给环境带来负面影响。

3.3 加强田间管理

研究发现，TYLCV在番茄苗期和田间土壤干燥时期病害发病情况较为严重。在种植番茄前需要彻底清除土壤表面杂草和残枝败叶，使用消毒剂进行消毒；在此阶段适当增施磷钾肥，保持田间湿润，促进番茄健康生长，提高其抗病能力。

3.4 选用抗病品种

抗病品种选育是当前防治TYLCV的最好方法之一。目前国内外学者已通过常规育种、分子标记辅助育种和基因工程育种得到一些抗病或耐病的商业品种。

4 番茄抗TYLCV病的育种方法

4.1 常规育种

针对TYLCV的抗病育种工作始于20个世纪70年代，当时主要措施是利用杂交将野生近缘种番茄中抗病或耐病基因转育到栽培品种中。番茄抗性基因主要来自野生近缘种，如智利番茄（Lycoper⁃sicon chilense）、醋栗番茄（Lycopersicon pimpinellifoli⁃um）及契斯曼尼番茄（Lycopersicon cheesmanii）。1988年，世界上第一个抗TYLCV的商品化品种TY-20出现，尽管在该品种中能检测到病毒，但植株表现的感病症状延迟，对番茄结实影响较小[32]。研究者在多个野生番茄材料发现抗病和耐病基因，如Ty-1基因，Ty-2基因[33]和Ty-3a与Ty-3b基因[34]。这些基因的抗病机理是干扰病毒CP合成。已成功应用的商业品种：如瑞士先正达公司选育的迪芬尼（含Ty-1基因）、齐达利（Ty-3a）和拉比（Ty-3a），法国Clause蔬菜种子公司选育宝丽（Ty-3a）。我国选育的抗TYLCV番茄新品种如西农2011（Ty-1）、浙粉701（Ty-2）、浙粉702（Ty-3a）、浙杂502（Ty-3a）。

4.2 分子标记育种

近年来，分子标记技术开始应用于番茄育种工作。该技术最大优点是减少育种年限，加速育种进程，目前已被广泛应用到番茄抗TYLCV育种。Zamir等将耐TYLCV的主效基因（Ty-1）定位到番茄第6染色体上的着丝粒端[34]。之后，Ty-2被Garcia定位在第11号染色体长臂终端，在TG36 （84.0 cM）和TG393（103.0 cM）之间[35]；2007年，Ty-3被Ji等定位在第6号染色体上，距离Ty-1仅20 cM[36]；2008年，Ji等又将Ty-4定位在第3号染色体上C2-At4g17300（81.0 cM）与C2-At5g60160 （83.3 cM）之间[37]；同年，一个源于秘鲁番茄TY172的新抗病主效基因Ty-5和4个微效QTL被Anbinder等分别定位。其中Ty-5定位在4号染色体上，其他4个微效QTL分别被定位在1、7、9、11号染色体上[38]。

4.3 基因工程育种

基因工程育种相比传统方法具有明显优越性：①育种周期短；②适用范围广，尤其适用于传统育种因缺乏抗原而难以进行的抗病育种；③在育种过程中不会引入其他不良农艺性状基因等。目前，番茄抗病毒病基因工程主要采用病毒单一功能基因（如外壳蛋白基因）、病毒反义或卫星RNA及RNAi等方法先后成功获得抗病毒番茄株系。

Powell等首次获得TMV-CP转化植物[39]，在番茄中开始有大量试验工作并取得成功。20世纪90年代，以TYLCV的AV1和AC1等为目标基因转到番茄中，研究结果发现转基因番茄对TYLCV的抗性显著提高。2006年Fuentes等利用间隔区为内含子的RNAi载体构建技术，将AC1基因3'端片段转到易感病的番茄品种中，研究结果表明，转基因番茄在病毒接种2个月后依然没有呈现发病症状[40]；同年，Bucher等利用RNAi技术提高转基因植物对四种番茄斑萎病毒的抗性[41]；研究发现以TYLCV基因组上的非编码区、AV2、AC4、CP、AC1和为目标基因构建RNAi载体转到番茄中均能提高番茄对TYLCV抗性；Abdelbacki等发现乳清蛋白对TYLCV也有抑制作用[42]；2014年Patrick等成功克隆抗病基因Ty-1和Ty-3并进行遗传转化，取得重要进展[43]。

5 TYLCV病的抗病鉴定

5.1 烟粉虱接种鉴定法

常用的烟粉虱接种方法有以下三种：

①温室烟粉虱接种：使用隔离温室的健康番茄喂养B型烟粉虱，烟粉虱种群量达到较高水平后，取部分烟粉虱转移到感病番茄植株上进行喂养并保持较高种群量。即可对3～4片真叶的待测番茄植株进行接种传毒[44]。该方法虽然能进行传毒，但番茄真叶表面的蜡质会对烟粉虱的取食偏好起抑制作用，很可能错误地将感病材料当作抗病材料。此外，该接种方法不适于鉴定中抗或低抗的番茄材料。

②网罩烟粉虱接种：该方法是在网罩里放置一定数量的B型烟粉虱对感病番茄植株进行取食，烟粉虱种群量达到较高水平后，将这些带毒的烟粉虱转移至健康的待测番茄植株上取食，然后喷洒吡虫啉杀虫剂杀死烟粉虱，并将植株转移到防虫温室中，观察番茄生长状态。该方法是一种科学、高精确性的抗病性鉴定法，但只适合小批量的材料检测。

③露地自然接种：这是一种最简单的烟粉虱接种鉴定法。该鉴定法只需要将番茄放入含有病毒的田间进行自然传毒，但只适合在夏秋两季接种。除此之外，该方法重复性差，不适合单独用于育种计划。研究表明，该方法在接种一个月后仅有50%的植株感病，3个月时高达90%的植株染病[45]。Cohen等研究表明该方法接种的烟粉虱仅有3%～6%具有传毒能力[46]。

5.2 农杆菌接种法

农杆菌接种是指将TYLCV基因组的串联重复序列克隆到载体中转化到农杆菌中Ti质粒T-DNA上，以农杆菌作为载体进行的接种方法。通过农杆菌注射（Agroinjection）将侵染性克隆接种4～6叶期苗龄的番茄植株。该方法能将TYLCV转到叶片和整个植株使TYLCV系统性地侵染植株，导致诱发病症，操作简便、效率高、重复性好。此外，该方法还可以鉴定不同类型番茄对TYLCV的抗性[47]，但需对TYLCV的基因组片段进行克隆、转化，消耗大量时间；农杆菌注射法也存在注射量等问题，接种过程比较慢，只适于少量材料的鉴定。

5.3 嫁接接种法

嫁接接种法是采用感病番茄作为砧木，将需要鉴定的植株嫁接到砧木上。该方法可确保待鉴定植株持续暴露在病毒下，可用来筛选抗TYLCV材料。研究结果表明，带毒烟粉虱接种番茄嫩叶一周就可检测到TYLCV，两周时发现TYLCV可侵染到其他组织。于力等研究发现，在嫁接后一个月后所有待测植株均检测到病毒存在[48]。该方法不足是对嫁接技术要求高，不适合大量材料的鉴定。但不受温度、季节和地区限制，可以四季进行接种鉴定。

5.4 机械接种法

机械传毒是以感染TYLCV的植株作为毒源，磨成汁液并溶于缓冲液。人工接种到健康植株的叶片上，观察植株生长状态鉴定植株是否抗病。但该接种法成功率不高，一般建议少用或不用该接种法[49]。

5.5 基因枪接种法

基因枪接种法是利用PCR技术将TYLCV的基因组DNA克隆到植物转化载体上，然后采用基因枪轰击待检测番茄植株，观察番茄发病症状。该接种法在番茄上成功率低，一般建议不用或少用该接种法[50]。

6 展 望

随着设施蔬菜产业发展，番茄黄化曲叶病毒病危害由露地拓展至保护地栽培，危害程度愈演愈烈。由于该病毒变异速度较快，科学防治减少损失措施必须加强，而选育抗病能力强且遗传稳定优良品种是最佳选择。应加强对抗性资源的开发利用，利用分子生物学与基因工程技术创新培育抗性品种，加快品种选育过程势在必行。

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Research progress on the tomato yellow leaf curl virus disease

SUNSheng,KANG Xiuping,XING Guoming,XING Xiaojuan,XU Xiaoyong,ZHANG Yi,ZHANG Jing, WANG Yan,ZHENG Shaowen,NIE Hongmei(School of Horticulture,Shanxi Agricultural University, Taigu Shanxi 030801,China)

The research progress was described on tomato yellow leaf curl virus disease that was about the present research situation,symptoms,cure mechanism,detection methods,controlling measures, breeding methods,identification means and other aspects in the paper.Meanwhile,the research direction and the tomato yellow leaf curl virus disease prevention work was prospected.

tomato yellow leaf curl virus;pathogenesis;breeding;resistance identification

S436.412.1+1

A

1005-9369（2015）05-0102-07

2014-11-25

山西省科技攻关项目（20130311014-2，20110311015-3）；山西省高等学校青年科技创新项目（2014130）

孙胜（1977-），男，副教授，博士，研究方向为蔬菜栽培育种。E-mail：sunsheng_2004@126.com

邢国明，教授，博士生导师，研究方向为蔬菜栽培生理生态与生物技术育种。E-mail：xingguoming@163.com