金柑DNA结合蛋白的分离及染色质体外组装研究

李梦芸，李光锋,2，杨 华，黎子云，吴小平，饶力群

（1. 湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙 410128；2. 湖南食品药品职业学院，湖南长沙410208）

金柑DNA结合蛋白的分离及染色质体外组装研究

李梦芸1，李光锋1,2，杨 华1，黎子云1，吴小平1，饶力群1

（1. 湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙 410128；2. 湖南食品药品职业学院，湖南长沙410208）

为了研究DNA与DNA结合蛋白的相互作用，以及无细胞的染色质体外组装过程，从金柑叶片中提取总DNA，利用微晶纤维素得到DNA-纤维素层析配体，经DNA-纤维素层析分离得到DNA结合蛋白，再将纯化的DNA和DNA结合蛋白在低盐条件下按一定比例混合，并进行电镜观察。结表表明，该混合物产生絮状沉淀，电镜观察发现念珠状的小黑圆点，因此推测DNA和DNA结合蛋白发生互作，可能形成核小体引起染色质体外组装。

金柑；DNA结合蛋白；纤维素层析；体外组装

在真核生物细胞核中，染色质是由DNA和组蛋白一起被压缩成一个高度有序的结构，以核小体为基本结构单位。由146 bp的DNA 围绕一个八聚体的组蛋白（两分子的H2A-H2B二聚体，两分子的H3和两分子的H4）形成核小体的核心结构，核小体之间由组蛋白H1与DNA结合，并经过进一步的折叠缠绕及自我组装形成染色质高级结构[1-4]。然而，高度致密的染色质结构会影响DNA的复制、重组、链裂解、转录和修复等[5-7]，调节染色质的结构是真核基因表达调控的关键步骤。在染色体水平上研究蛋白质与DNA的相互作用过程能有效地反映体内蛋白质调控基因表达的真实状况。

序列特异性DNA结合蛋白（Sequence-specifc DNA binding proteins) 能与DNA上特定的靶位点相互作用，从而在基因的表达和DNA复制、重组等过程中进行调控，与细胞周期中染色体的一系列变化相关，包括组蛋白、转录因子、单链结合蛋白、解链酶、DNA聚合酶以及RNA聚合酶等[8]。吕湘等[9]研究表明，DNA结合蛋白与DNA、组蛋白先形成复合物，再通过招募染色质重塑复合物，可引起染色质重塑，而应用不同的组装因子也可将DNA模板组装成适当的染色质结构[10]。

本研究通过提取真核细胞DNA结合蛋白，与基因组DNA相互作用，建立起无细胞的染色质体外组装，以期为进一步研究如何改变染色体空间构象和引起基因的激活或抑制转录提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试材的处理

挑选长势相近的1年生金柑（Fortunella margarita (Lour.) Swingle），摘取叶片若干，保存于－80℃超低温冰箱中，备用。

1.2 方法

1.2.1 金柑叶片蛋白质的提取 用液氮将30 g金柑叶片研磨成粉末；加入100 mL蛋白质提取液[20 mmol/L Hepes (pH值 7.5)，1.5 mmol/L MgCl2，0.4 mol/ L NaCl，0.2 mmol/L EDTA，25%甘油，0.5 mmol/L DTT，0.2 mmol/L PMSF]，充分混匀；4℃条件下浸提2 h，12 000 r/min离心20 min；上清液即为金柑叶片蛋白质溶液。

1.2.2 DNA-纤维素层析分离DNA结合蛋白 将层析管中装入纤维素晶粉固定的双链化DNA，先用0.1 mol/L NaCl溶液平衡；再用5 mL金柑叶片蛋白质溶液上柱，仍用0.1 mol/L NaCl溶液洗脱；待洗净杂质后，改用1 mol/L NaCl溶液洗脱。按2 mL每管进行收集，同时用紫外可见分光光度计测定吸光度，直至流出液的吸光度回归基线，将洗脱获所得的DNA结合蛋白混合备用[11-12]。

1.2.3 蛋白质SDS-PAGE电泳 蛋白质样品和DNA结合蛋白混合样品均加入5倍样品缓冲液中混匀，沸水浴5 min，离心并等量点样，采用4%浓缩胶及12.5%分离胶进行不连续垂直平板电泳，扫描拍照，使用PDQuest 1-D软件对图像进行分析处理。

1.2.4 DNA结合蛋白的酶解及质谱鉴定 参照考王鸿丽[13]和廖翔[14]的研究方法进行。

1.2.5 染色质体外组装 取1.2.2中经1 mol/L NaCl洗脱收集得到的蛋白质溶液1 mL，加入浓度OD260为10的金柑叶片DNA溶液50 μL，温和混匀，4℃静置3 h，再加入9 mL 0.01 mol/L的EDTA溶液，温和混匀，4℃静置，并观察直至絮状的沉淀出现，用双蒸H2O分散少量沉淀并滴加到铜网上，待水分晾干后，使用投射电镜观察并拍照。

2 结果与分析

2.1 DNA-纤维素层析制备DNA结合蛋白

先用0.1 mol/L NaCl溶液洗涤杂蛋白，从第8管起出现紫外吸收峰，至第19管出现最大紫外吸收峰值，其后出现2个吸收峰，第48管后，其紫外吸光度低于0.001，持续洗脱到第100管，其紫外吸光度均低于0.001。再更换1 mol/L NaCl溶液洗脱DNA结合蛋白，从第107管起出现紫外吸收峰，至第113管出现第一个峰，此后出现几个未分开的吸收峰，到第135管后紫外吸光度低于0.001，为确保DNA结合蛋白洗脱干净，持续使用1 mol/L NaCl溶液洗脱至第170管，其紫外吸光度均低于0.001。将DNA结合蛋白和杂蛋白洗脱峰面积分别积分，其积分比约为1∶9（图1）。

2.2 SDS-PAGE分析DNA结合蛋白

从图2可以看出，经过DNA-纤维素层析得到的DNA结合蛋白条带明显比总蛋白条带要少，是因为总蛋白中一些低丰度的蛋白得到了富集，而大部分高丰度的蛋白得以去除，DNA结合蛋白相对分子质量基本上小于974 000，是以小分子量的蛋白为主。

2.3 DNA结合蛋白的质谱鉴定

将DNA-纤维素层析获得的蛋白质样品利用LCMS/MS分析，共获得2 062个肽段的信息，经检索鉴定得到28个同源蛋白（表1）。这些蛋白包括组蛋白、磷酸激酶、RNA合成相关的蛋白及一些功能未知的蛋白质等。

2.4 染色质体外组装

将金柑叶片的DNA与DNA结合蛋白在高盐的条件下混合，通过10倍稀释法使盐浓度降低，在稀释过程中发现溶液中逐渐出现絮状沉淀，随着絮状沉淀增多，絮状沉淀慢慢地靠拢聚集形成马尾状（图3）。

挑取少量马尾状沉淀，用双蒸H2O分散，再通过透射电镜下观察，发现沉淀物有如植物根系般，盘根错节，进一步发现在某些主链上有许多的分支，而这些主链和分支均是由一些球状体连接而成（见图4）。

在染色质体外组装体系中，成分有DNA、蛋白质以及无机盐（以NaCl为主）。显然，单独的纯的DNA或蛋白质，亦或是无机盐都不会在稀释的过程中产生沉淀，因此，沉淀的出现极可能是DNA和DNA结合蛋白相互作用形成了DNA-DNA结合蛋白复合物。据赵忠亮等[10]提出的4种体外染色质组装体系方法中，有一种为利用组蛋白转运媒介物（如：盐浓度透析、组蛋白结合蛋白等），形成组蛋白体系，此体系可产生规范的核小体，但是形成的核小体分布却不规则。因此，图4中如念珠状的小黑圆点极可能是核小体，进而推测DNA和DNA结合蛋白互作发生了染色质体外组装现象。

3 结论与讨论

所有在真核细胞中发生的如转录、复制、重组以及修复等生命过程，都需要染色质的参与。赵忠亮等[10]研究表明，高度包装的染色质是无法进行转录的，而在转录延伸的过程中，染色质必须经过解体才能完成转录，这就存在一个问题，即：蛋白质是如何涉足解体后的染色质的重新组装？而最早研究体外染色质的重新组装是在生理条件下依赖爪蟾卵母细胞的提取物，这些提取物富含酸性蛋白、核质蛋白以及组蛋白等，它们能有序地结合到DNA上，装配成有一定空间距离的多核小体，进而组装成染色质[15]。Monique Barat[12]的研究表明，利用DNA纤维素层析的DNA结合蛋白能与爪蟾卵母细胞的线粒体DNA在低盐条件下按约1∶1的比例结合形成如念珠状的核小体染色质。

本研究中利用纯化的基因组DNA和DNA结合蛋白进行了染色质的体外组装，结果表明二者可以发生相互作用，产生沉淀，通过电镜观察到类似念珠状的核小体。这一方面说明能有效采用DNA-纤维素层析方法获取得到DNA结合蛋白；另一方面也说明DNA与DNA结合蛋白也可以发生相互作用，组装成类似分布不规则的核小体，仍需进一步确认染色质是否重建。现代技术能在染色质包装的核小体水平上对转录的启动和延伸进行相关的生化与分子方面的研究，若能构建无细胞的染色质组装体系，这对于进一步研究蛋白质调控基因的表达具有重要意义。

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[11] Yang H，Huang L，Chun G．The genomic DNA immobilization on

Separation of Kumquat DNA-Binding Proteins and Chromatin Assembly in Vvitro

LI Meng-yun1，LI Guang-feng1,2，YANG Hua1，LI Zi-yun1，WU Xiao-ping1，RAO Li-qun1

（1. College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, PRC; 2. Hunan Food and Drug Vocational College, Changsha 410208, PRC）

In order to study the interaction between DNA and DNA-binding proteins, an acellular system of chromatin assembly in vitro was established. The total DNA of kumquat leaves were extracted, the DNA-cellulose chromatography ligand was obtained with the microcrystalline cellulose, and then DNA-binding proteins were isolated through the DNA- cellulose chromatography. Finally, the purifed DNA and DNA-binding proteins were mixed at a certain proportion under low salt conditions and then observed with electron microscopy. The results showed that the mixture produced flocculent precipitates, and beaded little black dots were found out by the electron microscopy. It indicated that DNA and DNA-binding proteins had interactions, which might lead to the formation of nucleosomes and cause chromatin assembly in vitro.

kumquat; DNA-binding protein; cellulose chromatography; assembly in vitro

S666

A

1006-060X（2015）08-0004-04

10.16498/j.cnki.hnnykx.2015.08.002

2015-06-25

国家自然科学基金 (No. 31200963)；湖南省教育厅优秀青年项目（No.13B046）；湖南省科技计划项目（No. 2009NK3096）；湖南省教育厅科学研究项目（No.13C576）

李梦芸（1988-），女，湖南双峰县人，硕士研究生，研究方向：植物抗逆生物化学；并列第一作者：李光锋（1964-），男，湖南宁远县人，博士研究生，研究方向：植物抗逆生物化学。

杨 华，饶力群