豆渣水溶性多糖的精制及抗氧化活性研究

朱昌玲，孙达锋

(南京野生植物综合利用研究院，江苏 南京 210042)

豆渣水溶性多糖的精制及抗氧化活性研究

朱昌玲，孙达锋*

(南京野生植物综合利用研究院，江苏 南京 210042)

豆渣；水溶性多糖；精制；抗氧化活性

大豆是我国七大粮食作物之一，有资料表明豆渣中碳水化合物的含量为60%～70%，豆渣作为一种廉价的大豆类工业的副产品，是多糖提取的理想原料。水溶性大豆多糖(Water-soluble Soybean Polysaccharides)简称大豆多糖，主要成分是半乳糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸、鼠李糖、海藻糖等，是一种具有多种生物功能活性的天然酸性多糖，是大豆中的有效活性成分之一，具有抗氧化、抗病毒、调节机体免疫力等功效，有着良好的生理保健功能。已经成为当今研究的热点，发达国家十分重视其开发利用研究，并已有许多产品面市[1-4]。目前，国内关于豆渣水溶性多糖方面的研究报道很少，因此对豆渣水溶性多糖的提取、精制及其体外抗氧化活性进行研究，将为豆渣多糖在天然抗氧化剂和功能性食品领域的开发应用提供理论基础和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

新鲜豆渣，购于菜市场，烘干粉碎备用；淀粉酶型号为640034361；中性蛋白酶购于诺维信(中国)生物技术有限公司；试剂均为分析纯或化学纯。

主要仪器：6SH-1反应釜(威海化工器械有限公司生产)；SP-75系列紫外可见光分光光度计； HH-2数显恒温水浴锅； JJ-1电动搅拌器； WH-1微型旋涡混合仪；DL-102A型电热鼓风干燥箱。

1.2 方法

1.2.1 豆渣水溶性粗多糖的制备方法

称取一定量的干豆渣，加水搅匀，倒入高温反应釜进行高温蒸煮，控制蒸煮时间为90 min，蒸煮温度为135 ℃；反应结束后，用滤布进行粗过滤，再将滤液在3 000 r/min下离心15 min得上清液；旋转蒸发浓缩，干燥得水溶性粗多糖。

1.2.2 豆渣水溶性多糖的精制方法

精制工艺流程：豆渣粗多糖→脱脂→淀粉酶水解→蛋白酶水解→离心、浓缩、醇沉、干燥→豆渣多糖。

脱脂处理：用适量的乙醚(或石油醚)浸泡，除脂肪。

淀粉酶水解：配制浓度为10%的豆渣粗多糖溶液，加0.5%中温淀粉酶，70 ℃水解4 h。

蛋白酶水解：加入0.5%中性蛋白酶， 60 ℃下水解3 h，水解结束后进行灭酶处理。

离心、浓缩、醇沉、干燥：离心得上清液，经旋转蒸发浓缩后，按其3倍体积加入95%乙醇，4 ℃静置沉淀8 h，抽滤、真空干燥。

1.2.3 多糖的测定方法

总糖的测定：苯酚-硫酸法[5]；还原糖的测定： DNS法[6]。

按以下公式进行计算 多糖含量(mg/mL)=总糖含量(mg/mL)-还原糖含量(mg/mL)

多糖的纯度(%)=(多糖质量/样品质量)×100，其中多糖质量(g)=多糖含量(mg/mL)÷1 000×体积(mL)

1.2.4 多糖对超氧阴离子自由基的抑制作用的测定方法[7]

向试管中加入一定体积的浓度为2 mg/mL的样品，再加入6.0 mL 50 mmol/L pH 8.2的Tris-HCl缓冲液，最后用蒸馏水补足至9 mL，摇匀，于37℃水浴10 min。取出后加入37 ℃预热过的3.5 mmol/L邻苯三酚溶液1.0 mL，精确反应6 min，立即用0.5 mL 8.0 mol/L的浓盐酸终止反应，于320 nm波长处测定吸光度，根据吸光度值计算清除率，同时以0.2 mg/mL的抗坏血酸代替样品作为阳性对照。

1.2.5 多糖对羟基自由基(·OH)的清除能力的测定方法[7]

在试管中依次加入一定体积的浓度为1 mg/mL样品， 9 mmol/L的FeSO4-EDTA溶液1 mL， 9 mmol/L的水杨酸-乙醇溶液1 mL (空白不加)，最后各管再加8.8 mmol/L H2O21 mL，各管用蒸馏水足至5 mL，摇匀，于510 nm处测吸光度，根据吸光度值计算清除率，同时以等体积、等浓度的抗坏血酸代替样品作为阳性对照。

1.2.6 多糖还原力的测定方法[7]

向试管中加入一定体积浓度为1 mg/mL的样品，用磷酸盐缓冲溶液(0.2 mol/L，pH6.6)补足至2.5 mL。再加入5 mL质量分数1%的铁氰化钾，置于50 ℃恒温水浴中反应20 min。再加入5 mL质量分数10%的三氯乙酸溶液，混合后在3 000 r/min下离心10 min。取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL质量分数1%的FeCl3溶液，摇匀，10 min后测定其在700 nm处的吸光值，吸光度值越大表示还原力越强。同时以等体积的0.1 mg/mL的BHT代替样品作为阳性对照。

2 结果与分析

2.1 豆渣水溶性多糖精制前后纯度对比

表1 豆渣水溶性多糖精制前后多糖纯度对比

水溶性豆渣粗多糖杂质多，性能不稳定，需要进行精制得到性能优良的水溶性豆渣多糖。由表1可以看出，豆渣水溶性粗多糖通过精制处理后纯度得到了明显提高。因为酶水解能脱除其中与多糖分子紧密结合的非糖类成分。

超氧阴离子自由基是在生命活动的代谢过程中产生的一种重要的自由基,具有很强的氧化能力[8]。由图1可以看出，豆渣多糖对邻苯三酚法反应产生的超氧阴离子自由基具有明显的清除作用，且呈现良好的量效关系。图1还显示了浓度为2 mg/mL的豆渣多糖对超氧阴离子自由基的清除与浓度为0.2 mg/mL的抗坏血酸的对比关系。

图1 豆渣多糖对·清除能力

2.3 豆渣多糖对羟基自由基的清除能力

羟基自由基是最活泼的自由基,也是毒性最大的自由基,它可以与活细胞中任何分子发生反应造成损害,且反应速度极快,被破坏的分子遍及糖类、氨基酸、磷脂、核苷和有机酸等[8]。利用Fenton反应产生羟基自由基，水杨酸法检测羟基自由基及物质清除羟基自由基的能力。在此法中，羟基自由基进攻水杨酸分子的苯环产生能用分光光度法测量的羟基化合物2，3-二羟基苯甲酸，可用该产物生成的多少来描述羟基的量及待测物质清除羟基自由基的能力。从图2可以看出，豆渣多糖对Fenton反应产的羟基自由基具有明显的清除作用，但对羟基自由基的清除能力不及等浓度的抗坏血酸。

图2 对·OH清除能力

2.4 豆渣多糖还原力的测定结果

物质的还原能力与其抗氧化活性之间有着明显的相关性，还原能力的高低可以间接反映抗氧化能力的强弱。由图3可以看出，豆渣多糖具有较强的还原力，且呈一定的量效关系，但本实验条件下多糖的还原力不及BHT。

图3 豆渣多糖还原力测定结果

3 结 论

(1)豆渣水溶性粗多糖通过脱脂、酶解精制处理后，多糖的纯度得到了明显提高，由74.60%提高到了87.45%。

[1] 谭永辉,王文生,秦玉昌,等.豆渣中水溶性大豆多糖的提取与应用[J].大豆科学,2008(1):150-153.

[2] 范远景,张倩,朱昺.豆渣中水溶性大豆多糖提取及组分鉴定[J].食品科学,2007(1):295-298.

[3] 周丽珍,刘冬,李艳,等.高温蒸煮结合酶解改性豆渣膳食纤维[J].食品研究与开发,2011(1):27-30.

[4] 宋慧,苗敬芝,董玉玮. 双酶法提取大豆多糖及其抗氧化性研究[J].中国食品添加剂,2011(5)：89-93.

[5] 张维杰.糖复合物生化研究技术[M].2版.杭州:浙江大学出版社,1999:244-246.

[6] 陈毓荃.生物化学实验方法和技术[M].3版.北京:科学出版社,2005:97-100.

[7] 张强,宫璐婵,孟凡荣,等.双孢菇多糖抗氧化活性的研究[J].中国林副特产,2010(1):16-19.

[8] 张强,牟雪姣,周正义,等.豆渣多糖的提取及其抗氧化活性研究[J].中国粮油学报,2007(5):49-52.

Refining Water-soluble Polysaccharides from Bean Dregs and Their Antioxidant Activity

Zhu Changling, Sun Dafeng*

(Nanjing Institute for Comprehensive Utilization of Wild Plants, Nanjing 210042, China)

Bean dregs of water-soluble polysaccharide after degreasing, enzyme hydrolysis are refined polysaccharide purity from 74.60% to 87.45%; Through the test of water-soluble polysaccharide of bean dregs to O2-inhibition and ·OH scavenging ability as well as the determination of reducing power, it showed good antioxidant activity.

bean dregs; water-soluble polysaccharide; refining; antioxidant activity

2014-11-21

江苏省产学研前瞻性联合研究项目(BY2012044)。

朱昌玲(1968—)，女(汉族)，高级工程师，本科。研究方向：生物工程。

*通讯作者：孙达锋。E-mail:sdafeng@163.com

10.3969/j.issn.1006-9690.2015.03.018

TS202

A

1006-9690(2015)03-0069-03