HPLC法测定菊花及其炮制品中主要成分的含量

付美霞，胡伶俐

(武汉市第五医院，湖北 武汉 430050)

HPLC法测定菊花及其炮制品中主要成分的含量

付美霞，胡伶俐*

(武汉市第五医院，湖北 武汉 430050)

目的：建立检测菊花及其炮制品种主要成分的方法，并对三批菊花及其炮制品中的主要成分绿原酸(C16H18O9)、木犀草苷(C21H20O11)、异绿原酸A(C25H24O12)进行含量测定。方法：色谱柱Agilent XBD C18(4.6 mm×250 mm，5.0 μm)，流动相乙腈/0.1%磷酸，流速1.0 mL/min，柱温25 ℃，检测波长348 nm。结果：三种化合物的分离度较好，理论塔板数较高，绿原酸：A=8.278 71C+4.935 05，R=0.999 9(n=7)，浓度范围为8.656～86.56 μg/mL；木犀草苷：A=15.866 45C-2.036 02，R=0.999 9(n=7)，浓度范围为4.16～41.60 μg/mL；异绿原酸A：A=8.514 90C+1.2142 8，R=1.0(n=7)，浓度范围为18.92～189.20 μg/mL，三种化合物的峰面积和浓度有良好的线性关系。结论：本方法能够准确快速地对菊花及其炮制中，主要成分进行定量分析，具有简便、稳定、准确等特点。

HPLC；菊花；绿原酸；木犀草苷；异绿原酸A

菊花是我们生活中最常见药食两用的中药之一，来源于菊科植物菊(ChrysanthemummorifoliumRamat.)干燥的头状花序，具有散风清热、平肝明目、清热解毒，用于风热感冒，头痛眩晕，目赤肿痛，眼目昏花，疮痈等[1]。绿原酸、异绿原酸A和木犀草苷是菊花中的主要化学成分。绿原酸具有清除自由基、抗菌消炎、抗病毒、降糖、降血脂、保肝利胆等多种功效[2-4]；异绿原酸A与绿原酸的药理活性相似，具有抗菌、抗病毒清除自由基、兴奋中枢神经系统等多种生物活性作用[3-7]；木犀草苷具有清热解毒、抗炎、镇咳、祛痰等作用[8-10]。

目前，临床上常用的菊花炮制品有：炒菊花、菊花碳、酒蒸品等。炮制通过对中药材或饮片的加工，从而达到减毒、增效、转变药性、提高药效等目的，通过炮制这项独特的制药技术，保证了中医临床用药的安全性和有效性。因此，控制炮制品中有效化学成分相当重要，本实验为菊花及其炮制品的质量控制提供参考方法，探讨炮制机理提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试品菊花品种为杭白菊，炮制品是炒菊花和菊花炭采购于浙江中医药大学中药饮片厂、浙江百草中药饮片有限公司和杭州华东医药饮片有限公司，经胡伶俐鉴定。供试品粉碎过后，过一号筛，备用。

对照品绿原酸(批号：111782-201304)、木犀草苷(批号：110753-201414)、异绿原酸A(批号：111718-201406)购自中国药品生物制品检验所；乙腈(色谱纯，美国TEDIA)，自制超纯水(美国Pall公司Cascade IX超纯水器)，甲醇、乙醇、磷酸(分析纯，南京化学试剂厂)

1.2 实验仪器

HPLC-1260色谱仪(美国安捷伦公司)；KQ-104型超声波清洗仪(昆山超声仪器有限公司)；万分之一电子天平(ALT160-4B德国科恩分析天平)

1.3 实验方法与结果

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBA SB-C18(4.6 mm×150 mm ，5 μm)；流动相：乙腈-0.1%磷酸(0～7 min10%→16%，7～18 min 16%→17%，18～24 min 17%→20%)；流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃；检测波长：348 nm；进样量：5 μL；

1.3.2 标准曲线的绘制

精密称取10 mg绿原酸对照品，置于容量瓶中加70%的甲醇定容到50 mL，即为200 μg/mL绿原酸母液；精密称取10 mg木犀草苷对照品，置于容量瓶中加70%的甲醇定容到100 mL，即为100 μg/mL木犀草苷母液；精密称取20 mg异绿原酸A对照品，置于容量瓶中加70%的甲醇定容到50 mL，即为400 μg/mL异绿原酸A母液。

精密量取1.0，2.0，4.0，5.0，6.0，8.0，10.0 mL上述配置好母液置于25 mL的容量瓶中，用70%甲醇稀释到刻度，摇匀，过0.45 μm的滤膜，取续滤液5 μL进样进行分析。以峰面积A对浓度C进行线性回归，测定结果三条得到标准曲线：绿原酸：A=8.278 71C+4.935 05，R=0.999 9(n=7)，浓度范围为8.656～86.56 μg/mL峰面积和浓度有良好的线性关系；木犀草苷：A=15.866 45C-2.036 02，R=0.999 9(n=7)，浓度范围为4.16～41.60 μg/mL峰面积和浓度有良好的线性关系；异绿原酸：A=8.514 90C+1.214 28，R=1.0(n=7)，浓度范围为18.92～189.20 μg/mL峰面积和浓度有良好的线性关系。

1.3.3 供试品的制备

精密称取药材粉末(过一号筛)0.25 g(每组3份平行)，置于50 mL具塞三角瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，称重，超声40 min，放冷，再次称重，用70%甲醇不足损失的重量，摇匀，过0.45 μm的滤膜，取续滤液，即得供试品溶液，进样量5 μL。

图1 三种对照品HPLC色谱图

1.3.4 菊花及其不同炮制品种主要化学成分含量测定结果

将上述1.3.3项制备的供试品，进入HPLC分析，根据峰面积计算出供试品中三种化合物的含量，结果如下表所示(表1)。

表1 菊花及其炮制品中三种化合物的含量

注:A为购于浙江中医药大学中药饮片有限公司；B为购于浙江百草中药饮片有限公司；C为购于杭州华东中药饮片有限公司。

图2 菊花及其炮制品HPLC色谱图

1.3.5 精密度

取1.3.3项下制备好的供试品溶液(生品)，连续进样6次，进样量5 μL，测得三种化合物的峰面积，并计算RSD值，绿原酸(1.6%)、木犀草苷(1.1%)、异绿原酸A(1.0%)，表明该方法精密度较好。

1.3.6 稳定性

取1.3.3项下制备好的供试品溶液(生品)，分别于0，1，2，4，8，12和24 h后进样分析，进样量5 μL，测得三种化合物的峰面积，并计算RSD值，绿原酸(1.9%)、木犀草苷(1.5%)、异绿原酸A(1.4%)，表明样品在24 h内稳定。

1.3.7 重复性

精密称取生品药材粉末6份，每份0.25 g，按1.3.3项下操作，测定并计算三种化合物的含量，6次测定值得RSD值，绿原酸(2.3%)、木犀草苷(1.4%)、异绿原酸A(1.1%)，表明该方法重复性较好。

1.3.8 加样回收率

采用加样回收法，取已知含量的生品药材粉末6份，每份0.12 g精密称定，分别加入计算量的绿原酸、木犀草苷、异绿原酸A，按1.3.3项下操作，测定并计算三种化合物的回收率，结果绿原酸回收率为99.1%、木犀草苷回收率为99.4%、异绿原酸A回收率为99.2%，RSD绿原酸(2.6%)、木犀草苷(1.9%)、异绿原酸A(1.7%)，在允许范围内表明该方法的准确度较好。

2 讨 论

(1)本实验考察了提取溶剂和提取方法的选择，绿原酸、异绿原酸A和木犀草苷三种化合物极性偏大，比较了甲醇和乙醇的提取效果，最终优化选择用70%的甲醇做提取溶剂，提取液中杂质较少，也能够提取完全。超声和加热回流相比，超声的效率更高，且杂质不易被提出。

(2)从实验结果中不难看出，经过炮制后三者组分的含量均减小，尤其是炒炭后，菊花炭中三种组分含量均急剧减低，这是由于高温使得化合物被破坏。炒炭后的菊花止血效果增加了，临床多用于月经过多而引起的头痛眩晕[11-12]。但是，和生品菊花相比抗菌、抗病毒、保肝利胆的功效消失了。

(3)从化学成分含量来看，炒菊花中三种化合物的含量与生品相比较均有不同程度的降低，这也能够科学地解释炒制过的菊花与生品和炒炭的不同，是因为炮制的温度和时间都不同，兼有两者的功效。

(4)中药必须经过炮制之后方能入药，中药炮制是根据中医理论，依照辨证施治用药的需要，以及中药自身性质和临床需要，所采取的一项传统制药技术。同一种药材，因生产和加工的环节不同，质量差异很大，直接影响疗效。当前用以控制饮片质量的标准是各省、市自治区制订的中药饮片炮制规范，而规范中的标准多数是依据形态、色泽、质地、气味等感官来判断饮片的真伪优劣，比较模糊，不易掌握，判断上也存在个体差异，不能保证质量。

因此，制订统一的炮制工艺及饮片的质量标准，通过科学客观的指标或参数，建立科学合理的质量标准，控制质量从而保证临床用药的安全有效。

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Determination of Chemical Constituents in Chrysanthemum and Processed Products by HPLC

Fu Meixia，Hu Lingli*

(The Fifth Hospital of Wuhan, Wuhan 430050，China)

Objective: To establish a methods for determination of chlorogenic acid, luteolin, isochlorogenic acid A in Chrysanthemum and processed products by HPLC. Methods: The separation was performed on Agilent XBD C18(4.6 mm× 250 mm, 5.0μm), the mobile phase consisted of acetonitrile/0.1% H3PO4at flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 348nm and column temperature was 25 ℃. Result: Those chemical constituents have been separated, chlorogenic acid:A=8.278 71C+4.935 05,R=0.999 9 (n=7), The linear rang was 8.656-86.56 μg/mL; Luteoloside:A=15.866 45C-2.036 02,R=0.999 9 (n=7), The linear rang was 4.16-41.60 μg/mL; isochlorogenic acidA:A=8.514 90C+1.214 28,R=1.0(n=7), The linear rang was 18.92-189.20 μg/mL, the peak area and concentration of the three compounds have a good linear relationship. Conclusion: The method can accurately and quickly determination of chlorogenic acid, luteolin, isochlorogenic acid A inChrysanthemumand processed products.

HPLC; Chrysanthemum; chlorogenic acid; luteoloside; isochlorogenic acid A

10.3969/j.issn.1006-9690.2015.01.008

2014-08-16

付美霞(1963-)，女，在职硕士研究生，从事药学工作。

*通讯作者：胡伶俐(1976-)，女，从事中药管理和调剂相关研究工作。E-mail: 932587106@qq.com

R284.1

A

1006-9690(2015)01-0026-04