肝病实脾法对肝硬化大鼠胃动素、胃动素受体及内毒素血症的影响*

徐嘉蔚 陈 斌△ 李 玲 何 琬 王国栋 刘 璇

1.湖南中医药大学第一附属医院 (湖南 长沙，410007) 2.湖南中医药大学中医学院医学基础教学实验中心 3.湖南中医药大学研究生院

肝硬化是临床常见的慢性进展性肝病，患者常伴有食欲减退、嗳气、早饱、腹胀、腹泻或便秘等症状，然而这些症状与胃排空功能下降、小肠的移行性运动复合波(MMC)异常、胃肠激素紊乱等胃肠病理生理改变密切相关。在肝硬化模型大鼠中发现其胃肠运动减弱，排泄时间明显延长［1］，这不仅影响食物的消化吸收，而且消化道对细菌的顺性机械排空作用也减弱，导致肠腔内细菌过度生长繁殖，菌群失调，细菌移位，内毒素产生增加［2］，加重肝微循环障碍、促进肝纤维化［3］，形成对肝脏的“二次打击”。本实验着重研究肝硬化模型大鼠血清胃动素(MTL)、胃肠平滑肌细胞胃动素受体(MTL-R)、门静脉内毒素水平的变化，并予“肝病实脾”法的代表方逍遥散及其拆方进行干预，以探索“肝病实脾”的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康Wistar 大鼠70 只，雌雄各半，体重(120～140)g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，合格证号:SCXK-(军)2012-0004。

1.2 药物和试剂 逍遥散由柴胡、当归、白芍、白术、茯苓、生姜、薄荷、炙甘草组成，药物均采用单味中药配方颗粒(广东一方制药有限公司);牛血清白蛋白(北京Solarbio 公司，批号:628C053);弗氏不完全佐剂(美国Sigma-Aldrich 公司，批号:1001646388);大豆胰蛋白酶抑制剂(sigma 公司，批号:1001789621);Ⅱ型胶原酶(invitrogen 公司，批号:17101015);显色基质鲎试剂盒(厦门市鲎试剂实验厂有限公司，批号:140325);大鼠MTL ELISA 试剂盒、大鼠MTLR ELISA 试剂盒(美国RD 公司，批号:20140919)。

1.3 仪器 SK3003 半自动生化分析仪(深圳市盛信康科技有限公司)，722s 可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司);ELX800 酶标仪(BioTek Instruments)，BX43 研究型正置显微镜(Olympus)，X1R 低温高速离心机(Thermo Fisher);JY92-Ⅱ型超声波细胞粉碎机(宁波新芝技术公司);DZKW-4 型电子恒温水浴锅(北京中兴伟业仪器有限公司)。

1.4 药物配制 将牛血清白蛋白液与等容积弗氏不完全佐剂混合在超声波细胞粉碎机上乳化，配成牛血清白蛋白乳化液。实验组用药为逍遥散，由柴胡15g、当归15g、白芍15g、白术15g、茯苓15g、生姜6g、薄荷6g、炙甘草9g 组成，对照组为逍遥散去健脾药物，由柴胡15g、当归15g、白芍15g、薄荷6g 组成。按照人与大鼠体表面积关系换算大鼠的生药日用量，得出大鼠逍遥散日用量8.64g/kg，逍遥散去健脾药物组日用量4.59g/kg，按照颗粒剂与生药剂量换算关系，将生药量换算成颗粒配方剂量，将所得逍遥散中药颗粒剂剂量配成质量分数为0.155g/ml 溶液，逍遥散去健脾药物为0.079g/ml 溶液，贮于4℃冰箱备用。

1.5 动物造模方法 参照文献方法［4］，用牛血清白蛋白致敏，模型组、对照组、实验组每次取0.5ml 牛血清白蛋白乳化液大鼠皮下多点注射，第1 次注射后间隔14d 进行第2 次注射，之后每间隔10d 注射一次，共4 次。末次致敏后1 周，大鼠尾静脉取血，琼脂双向扩散实验检查牛血清白蛋白抗体，取阳性抗体的大鼠进行攻击，每周两次尾静脉注射牛血清白蛋白，剂量每次0.4ml，牛血清白蛋白含量自2mg/次渐加0.5mg/次至4mg/次，维持此剂量，共15 次。正常组则给予等剂量生理盐水尾静脉注射，末次攻击24h 后处死。

1.6 分组与给药 将70 只Wistar 大鼠按雌雄各半，随机分为正常组、模型组、实验组和对照组4 组。正常组10 只，其余各组20 只。各组于攻击阶段开始灌胃给药，按10ml·kg-1·d-1的剂量给药，每天灌胃1 次，直到动物处死，用药时间为两个月，同时正常组、模型组给予等剂量生理盐水。

1.7 观察指标及检测方法

1.7.1 血清肝功能指标检测 麻醉处死大鼠，抽取门静脉血2ml，注入促凝管中，以SK3003 半自动生化分析仪分别测定ALT、AST、TP、Alb。

1.7.2 内毒素检测 严格无菌状态下，抽取门静脉血lml 装入无热原抗凝管，3 000 rpm，离心2min，取上清液血浆标本，行内毒素检测，具体方法参照显色基质鲎试剂盒说明书。

1.7.3 血清MTL 浓度检测 抽取右心房血2ml，注入促凝管中，3 000rpm，离心4min，取血清液，行酶联免疫吸附检测。

1.7.4 平滑肌细胞的制备 参照文献方法［5］，将大鼠麻醉处死，无菌剖腹取胃，剪取胃窦(距幽门0.8-lcm)，沿胃小弯剪开，以冰冷的生理盐水冲洗去食物残渣后，放入冰冷的Hepes-Ringer 缓冲液中，在无菌工作台中，除掉大网膜，剥去浆膜，用止血钳撕去粘膜，将新鲜的胃窦平滑肌0.5g 剪成2mm×2mm 小块，将肌块放入装有4ml 消化液灭菌离心管中孵育，通以100%纯O2，31℃水浴30min 后，离心(1 500r/min)4min。吸去消化液，在沉渣中再加消化液4ml，通以100%纯O2，31℃水浴30min 后，上述离心条件下离心4min。吸去上清液，在沉渣中加Hepes-Ringer 缓冲液4ml，摇匀后，离心4min，洗涤3 次后，肌块重浮于含10%牛血清白蛋白的Hepes-Ringer 液中，通入100%纯O2，31℃水浴振荡(30 次/min)25min。用40 目细胞筛网，将平滑肌细胞过滤，得到游离的单个平滑肌细胞，并收集于充满100%纯O2的30mL 的小锥形瓶中待用。在十二指肠与空肠交界处下1cm 处剪取4cm 长的肠组织，剖开剥去浆膜与粘膜，洗净，剪碎，装入含10ml 消化液的灭菌离心管中，通入100%纯O2，31℃水浴消化10 min，共2 次。消化完毕，1 800r/min 离心5min，弃上清液，加Hepes-Ringer 缓冲液洗涤2 次，弃上清液，再加入Hepes-Ringer 缓冲液10ml，通入氧气，31℃，振荡25min，而后用40 目细胞筛网过筛，充氧气。用血细胞计数板计数细胞数1 ×106/L，并用台盼蓝染液检查细胞存活率(90%以上)。

1.7.5 平滑肌细胞胃动素受体(MTL-R)检测 取上述所得的胃肠平滑肌细胞悬液，行酶联免疫吸附检测(ELISA)。

1.8 统计学方法 采用SPSS 16.0 统计学软件进行分析，所有数据均采用±s 表示，多组间计数资料比较采用方差分析，两组间比较采用LSD 检验，相关分析采用Pearson(简相关分析)，P ＜0.05 为差异有显著性意义，P ＜0.01 为差异有非常显著性意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肝功能结果 见表1。

表1 各组大鼠肝功能水平比较(±s)

表1 各组大鼠肝功能水平比较(±s)

与正常组比较，* P ＜0.01;与模型组比较，△P ＜0.05，▲P ＜0.01

2.2 各组大鼠门静脉内毒素、MTL、MTL-R 检测 结果见表2。

表2 各组大鼠门静脉内毒素水平，MTL、胃肠平滑肌细胞MTL-R 比较(±s)

表2 各组大鼠门静脉内毒素水平，MTL、胃肠平滑肌细胞MTL-R 比较(±s)

与正常组比较，* P ＜0.01;与模型组比较，△P ＜0.05，▲P ＜0.01;与对照组比较，★P ＜0.05

2.3 血清ALT、AST 与门静脉内毒素、血清MTL、胃肠平滑肌细胞MTL-R 的关系 血清ALT、AST 与门静脉内毒素具有正相关(r=0.391，0.334，P ＜0.05);与血清MTL 具有负相关(r=-0.535，P ＜0.01，r=-0.35，P ＜0.05);与胃窦平滑肌细胞MTL-R 具有负相关(r=-0.68，-0.451，P ＜0.01);与空肠平滑肌细胞MTL-R 呈负相关(r=-0.727，-0.503，P ＜0.01)。

2.4 血清TP、Alb 与血清MTL、胃肠平滑肌细胞MTL-R 的关系血清TP、Alb 与血清MTL 具有正相关(r=0.419，P ＜0.01，r=0.338，P ＜0.05);与胃窦平滑肌细胞MTL-R 具有正相关(r=0.403，0.468，P ＜0.01);与空肠平滑肌细胞MTL-R 具有正相关(r=0.482，P ＜0.01，r=0.328，P ＜0.05)。

3 讨论

肝脾相关理论是中医学五脏相关理论的重要组成部分。生理上肝脾相互为用、相互协调，而根据中医五行生克关系，肝脾在病理上也是密切联系，相互影响传变。肝木气有余，制己所胜，横逆乘脾，而成“木旺乘土”;肝气不及，则己所胜轻而侮之，而成“木虚土壅”;脾气不及，肝气虽然处于正常水平，然脾土不耐克伐，则“土虚木乘”。脾有实邪亦可反侮于肝，即为脾病传肝。治疗上张仲景在《金匮要略》里提出:“见肝之病，知肝传脾，当先实脾”的治疗原则。临床上脾胃虚弱患者易发生恶心呕吐、腹胀、腹泻或便秘等症状，可见脾胃的纳运升降功能与胃肠动力作用密切相关，而肝病患者常伴有胃肠功能障碍，脾虚因素贯彻始终［6］。故临床在治疗肝病时，常采用“肝病实脾”法，先实其脾气，防止肝邪犯脾，导致疾病进一步发展。

肝硬化患者胃动素受体表达与胃排空时间具有相关性，胃窦黏膜胃动素受体表达降低可能参与了肝硬化患者胃排空障碍［7］。失代偿性肝硬化时小肠的移行性运动复合波(MMC)存在异常，且与Child-Pugh 分级相关［8］。肝脏受损时释放大量细胞因子和炎症介质，如前列腺素E2(PGE2)能引起胃肠运动紊乱，使胃肠移行性复合波(MMC)消失［9］。而胃动素(MTL)是一种重要的调节胃肠消化功能的胃肠激素，可直接作用于平滑肌上的胃动素受体，通过受体活化钙通道，引起平滑肌细胞胞质游离钙浓度升高［10］，导致平滑肌收缩加强，增加移行性复合运动(MMC)，促进胃肠运动，可将空腹时吞下的唾液、胃黏液、上次进食后遗留的残渣、脱落的细胞碎片和细菌等清除干净，防止结肠内的细菌在消化间期逆行入回肠，起“清道夫”的作用。而MMC 的改变及消失会引起肠道菌群失衡及上移，过度生长的细菌产生各种毒素，引起各种并发症，如肝性脑病、自发性腹膜炎、肠源性内毒素血症等，可加重肝脏的原发疾病，形成对肝脏的“二次打击”［11］。

逍遥散始载于《太平惠民和剂局方》，既补肝体，又助肝用，气血兼顾，肝脾并治，故为调和肝脾之名方。临床上常用其加减治疗肝纤维化，实验研究也发现逍遥散具有保肝护肝作用，减轻肝细胞变性、坏死，抑制炎细胞浸润，阻抑肝细胞的纤维化［12］。本实验对其拆方，将原方组与去掉健脾药物(白术、茯苓、生姜、炙甘草)进行比较，发现逍遥散原方组对实验组肝硬化大鼠的ALT、AST 下降，TP、ALB 升高，减低门脉内毒素水平，增加MTL，胃窦及空肠平滑肌细胞MTL-R 等方面具有优势，说明逍遥散具有保护肝硬化大鼠肝功能以及促进胃肠动力的作用。而对照组在ALT、AST、TP、门静脉内毒素水平、MTL、胃窦平滑肌细胞MTL-R 等方面和模型组无差异，说明去掉健脾药物则改善肝功能、促进胃肠动力及预防内毒素血症的作用明显下降，逍遥散对肝脏的保护作用受影响。并且实验组和对照组在增加胃窦平滑肌细胞MTL-R 方面有差异，说明健脾药物有增加胃窦平滑肌细胞MTL-R 的功能，可能为“肝病实脾”法的作用机制之一。通过ALT、AST、TP、ALB 与MTL、胃窦及空肠平滑肌细胞MTL-R相关性方面研究，显示可以通过直接增加MTL、胃窦及空肠平滑肌细胞MTL-R，预防内毒素血症，而间接恢复肝功能;以及通过恢复肝功能，间接促进胃肠动力的作用。如李东垣所说“脾胃之气既伤，而元气亦不能充，而诸病之所由生也”。提出“内伤脾胃，百病由生”，元气是健康之本，而脾胃是元气之本，因此注重扶养脾胃，借以护养元气，所谓“正气存内，邪不可干”。疏肝的同时加以健脾，“肝病实脾”法才能发挥综合作用，对缓解病情、改善预后具有十分重要的意义。

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