黄连解毒汤HPLC指纹图谱的建立

陈莉雯 李毅民 谢瑞芳 周 昕

上海中医药大学附属龙华医院药剂科 (上海200032)

△通讯作者

黄连解毒汤HPLC指纹图谱的建立

陈莉雯 李毅民 谢瑞芳 周 昕△

上海中医药大学附属龙华医院药剂科 (上海200032)

目的：建立黄连解毒汤水煎液高效液相色谱法(HPLC)指纹图谱，为黄连解毒汤的质控提供依据。方法：采用HPLC-DAD检测器，XDB-C18PN990967-902色谱柱(4.6×250mm,5μm)；流动相A为乙腈，流动相B为0.1%磷酸水，流速为1 mL/min，柱温：25℃，检测波长：280 nm、240nm，梯度洗脱黄连解毒汤样品。结果：建立了含有30个色谱峰的高效液相色谱图，均得到了良好的基线分离；同时对盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸药根、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、栀子苷等指标成分进行了含量检测。结论：该方法简便快捷、精密度高、重现性好、回收率稳定，可用于黄连解毒汤的质量控制。

本实验收集了10个批次不同产地、不同生产时间、不同厂家的黄连、黄芩、黄柏、栀子等药材，按处方比例交叉组方后通过高效液相色谱法(HPLC)建立了黄连解毒汤水煎液的HPLC指纹图谱，并对其方法学进行了考察，同时测定其中三大类(黄酮类、生物碱类、环烯醚萜类)7种成分(盐酸药根碱、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、栀子苷)的含量，为该方的全面质量控制提供依据。

1 仪器与材料 仪器：美国惠普公司的Agilent 1100高效液相色谱仪、上海医科大学仪器厂的XW-80A旋涡混合器、上海必能超声仪器公司的SB2200 超声仪、上海医用分析仪器厂的Sartorius BS110S精密电子天平、TGL-16G 台式高速离心机、郑州长城科工贸有限公司的SHB-III循环水式多用真空泵、上海跃进医疗器械厂的XMT-152电热恒温干燥箱。

试剂：HPLC甲醇(德国默克公司)、HPLC乙腈(德国默克公司)、磷酸(上海联合化工厂)、所用水均为纯净水，通过Milli-Q 水处理系统(Millipore, Bedford, MA, USA)进行处理。

对照品：栀子苷(批号110749-200714)，盐酸巴马汀(批号110732-200907)，盐酸小檗碱(批号110713-200208)，黄芩苷(批号110715-200413)，黄芩素(批号111595-0200905)等均购自中国药品生物制品检定所(纯度>99%)。盐酸药根碱(批号110733-201108)，汉黄芩素(批号111514-200403)等购自中国食品药品检定研究所(纯度>99%)。

药材：按处方量交叉组合不同批次的黄连、黄芩、黄柏、栀子药材，组成10个批次的黄连解毒汤(见表1)。

2 方法与结果 色谱条件：采用XDB-C18 PN990967-902色谱柱(4.6×250mm,5μm)；通过流动相A为乙腈和流动相B为0.1%磷酸水进行梯度洗脱，具体条件如图1所示；流速为1 mL/min；柱温：25℃；检测波长：280 nm(栀子苷检测波长为240 nm)；进样量：5 μL；检测时间：90 min。

图1 黄连解毒汤色谱条件

对照品溶液的制备：精密称取盐酸小檗碱4 mg、盐酸药根碱0.6 mg、盐酸巴马汀0.8 mg、黄芩苷4.7 mg、黄芩素0.65 mg、汉黄芩素0.65 mg、栀子苷7.2 mg，将所称取的药品分别置于5 mL量瓶，应用甲醇定容，并进行不同浓度的稀释，0.22 μm微孔滤膜滤过即为对照品溶液。

供试品溶液的制备：对组合成的10个批次黄连解毒汤分别加10倍量水进行处理，冷浸30min，武火加热至沸后文火保持微沸20min，注意趁热过滤，再加水8倍量，武火加热至沸后转为文火微沸20min，并趁热过滤，将2次滤液进行合并。用10mL的量瓶分装合煎液，每瓶各2mL，再加甲醇约至10mL，超声提取20 min，冷却至室温，补充溶剂至刻度，摇匀，静置过夜后，取上清液，进行离心(10,000 转/min)10 min，再经过0.22 μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。

表1 药材产地及购买厂家来源

标准曲线的制定：将对照品溶液精密吸取注入色谱仪，进样量为5 μL，测定峰面积按2.1项方法，以峰面积为纵坐标，对照品含量为横坐标，制定标准曲线。

精密度及加样回收率试验：按高、中、低剂量将同一份黄连解毒汤(JQZJ3)分别加入对照品溶液，按2.3项下的处理得供试品溶液，连续测定3次分别于1d内完成，以5μL为每次进样量，记录峰面积，计算回收率、日间及日内精密度。分别测定各对照品的最低检测限(LOD)及最低定量限(LOQ)于信噪比(S/N)为3、10时。

稳定性试验：取同一份黄连解毒汤的供试品溶液，在0,2,4,24,48 h分别进样5 μL，记录峰面积，计算RSD，考察色谱条件的稳定性。

重现性试验：选取黄连解毒汤合煎液2 mL，按2.3项下药液处理方法平行处理3份样品，按照2.1项下色谱条件，进样5 μL，考察方法重现性。

供试品测定：按照2.1.项下色谱条件，进样3 μL，检测分析，记录90 min色谱图，每个供试品溶液进样3次，建立黄连解毒汤合煎液的HPLC指纹图谱。

数据统计：参照建立的标准曲线，采用回归分析的方法计算样品指标成分的含量。

以参照物对应的色谱峰(s)的相对保留时间和峰面积为1，各指纹峰保留时间与同一图谱中对照峰的保留时间的比值为各指纹峰的相对保留时间RRT)，各指纹峰峰面积与同一图谱中对照峰的峰面积的比值为各指纹峰的相对峰面积(RPA)，计算各批药材指纹图谱的共有峰的RRT和RPA。

采用国家药典委员会开发的中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004年A版)，叠加供试品的指纹图谱。对各批次药材及煎液运用夹角余弦法计算相似度。根据几何学多维空间的向量夹角制定向量余弦法，把两个指纹当作两个向量，计算夹角余弦相似度，进行相似度分析。

图谱情况：从供试品图谱可以看出，在现有色谱条件下，7个指标成分在280 nm检测波长下均得到良好的基线分离(图2)。而栀子苷在240 nm检测波长下峰型更清晰可见，因此，这里将黄连解毒汤在240 nm检测波长下的指纹图谱单独列开，以更好的观察指标成分栀子苷(图3)。

检测波长为280 nm时一共得到30个共有峰，其中3为栀子苷，15为盐酸药根碱，17为黄芩苷，18为盐酸巴马汀，19为盐酸小檗碱，27为黄芩素，28为汉黄芩素(图2)。

(3:栀子苷,15:盐酸药根碱,17:黄芩苷,18:盐酸巴马汀,19:盐酸小檗碱,27:黄芩素,28:汉黄芩素)

图3 黄连解毒汤传统煎煮色谱图 (240 nm)(1:栀子苷)

方法学结果表明：各指标成分在相应的范围内，均有良好的相关系数(>0.9994)，线性关系良好(表2)；除了黄芩素日间RSD=10.32%外，各指标成分的日内及日间RSD均<2.50%，肯定了本方法的精密度；定量限及最低检测限均能满足样品测定的要求；栀子苷回收率为92.47%～106.86%，盐酸小檗碱回收率为110.97%～115.14%，盐酸药根碱回收率为基本为112.26%～116.26%，盐酸巴马汀回收率为111.97%～112.65%，黄芩苷回收率为105.46%～107.69%，黄芩素回收率为87.32%～101.09%，汉黄芩素回收率为98.43%～110.14%，表明回收率良好。供试品主要指标的成分保留时间控制在：RSD为0.05%～0.33%，相对峰面积RSD为0.18%～1.72%，由此可知该试验方法在48h内基本稳定。主要指标成分相对保留时间的RSD均<0.8%，相对峰面积的RSD在1.09%～4.83%之间，表明该方法重现性良好。总言之，现有色谱法精密度、稳定性、重现性、回收率良好，可以进行下一步分析。

表2 标准曲线的制定

对照品回归方程相关系数(r)线性范围(μg)栀子苷y=1349.21x-20.740.9999660.11～7.20盐酸巴马汀y=1429.77x+2.550.9999330.16～1.12盐酸药根碱y=1485.35x+13.330.9996990.12～0.60盐酸小檗碱y=1215.79x+18.850.9997680.12～3.20黄芩素y=2810.60x-31.250.9997130.07～0.78汉黄芩素y=4144.87x-31.020.9998530.02～0.65黄芩苷y=2445.25x-67.110.9994320.48～4.70

指标成分含量结果：对黄连解毒汤水煎液不同批次的成分进行分析，结果表明(表3)：不同批次的指标成分含量具有一定差异，RSD在8.91%～45.38%之间，有的成分含量甚至可以相差数倍，如ZW17与ZW18中的黄芩苷、ZW18与ZW20中的黄芩素。

表3 不同批次黄连解毒汤水煎液指标成分含量(mg/g)

相似度结果：在黄连解毒汤水煎液图谱中，黄芩苷峰在10批合煎液中基本一致，且黄芩苷有合理的洗脱时间和已知的药理活性，因此将黄芩苷选为参照峰。以此为对照计算相对保留时间和相对峰面积。结果表明，各色谱峰的相对保留时间的RSD均小于1%，但是相对峰面积的RSD较大，说明药液各批次的保留时间相对稳定，但各批次峰面积含量有一定差异。

3 讨 论 黄连解毒汤首载于《肘后备急方》，为清热解毒经典名方，具有镇痛、抗炎、抗肿瘤、抗真菌、抗血小板、抗氧化等药理作用[1-4]。可以单独或联合其他药物治疗不稳定型心绞痛、糖尿病、骨髓瘤、肛周脓肿以及神经系统等多种疾病[6-10]。从药物学角度来看，黄连解毒汤的理化性质差异较大、化学成分较多、分离难度较大等，因此先前的很多研究报道都局限在整体药效学的研究，而缺乏对其全方经配伍组合、煎煮后的药理变化的深入探讨[11-14]。故此，本文着重研究该方煎煮后汤剂的化学特征。

目前，指纹图谱是一种已经应用成熟的分析方法，既有量的测定，又有质的特征检测，对研究对象可作出全面、综合地反映，较好的体现中药成分的复杂性和相关性。在中医药现代化的研究中，将指纹图谱质量评价体系引入到相关研究的成果较少，本实验建立了黄连解毒汤的HPLC指纹图谱，并采用相似度分析对指纹图谱进行了评价。结果表明，不同批次的黄连解毒汤指纹图谱特征、指标成分的含量存在一定差异，这说明产地、采收、加工方式、存储时间和方法以及煎煮过程对汤剂的质量均存在可能的影响。然而，如何将指纹图谱的丰富信息综合起来来评价中药质量是本文不足之处，有待今后将各种化学信息、药效信息综合起来，从而更系统地评价药物质量。

同时，从本次研究过程来看，高效液相色谱法在应用中可以收集到药品定性、定量的双重信息，可以将复杂的方剂化学成分进行个体化区分。这种点面结合的研究方法，是适合于中药方剂复合型组成特点的。在未来的探索中，我们应注重与方剂生产的实际结合，在目前中医药需求市场日益扩大的情势下，力图为中医药现代化生产提供相应的参考依据，使科学研究成果高效的转化为实际生产的方法。

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(收稿2014- 08-15；修回2014-11-25)

黄连解毒汤 @高效液相色谱法

O657.7

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.02.054