脑尔康对AD模型小鼠学习记忆及脑内AchE活性影响的拆方研究*

马新欣 李 玺 田 苑 王 娟

西安交通大学医学院第二附属医院心理精神科(西安 710004)

·实验研究·

脑尔康对AD模型小鼠学习记忆及脑内AchE活性影响的拆方研究*

马新欣 李 玺Δ田 苑 王 娟▲

西安交通大学医学院第二附属医院心理精神科(西安 710004)

目的：对复方中药脑尔康进行拆方研究，筛选出治疗阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease ，AD)模型小鼠药味精简，疗效较佳的组方。方法：70只小鼠随机分为7组，每组10只，采用腹腔注射氯化铝(AlCl3)溶液建立AD模型小鼠，空白组和模型组每天给予生理盐水0.5mL灌胃；其余各组每天分别给予相应药物14.3g/kg剂量灌胃，连续30d。观察各组小鼠学习记忆情况，并测定其右侧皮质、海马区AchE活性及其蛋白水平。结果：各用药组与模型组比较，全方及拆方1号学习记忆功能明显改善(P⟨0.05或P⟨0.01)，海马、皮质区AchE活性均明显降低(P⟨0.01)，其蛋白水平均明显升高(P⟨0.05或P⟨0.01)；各拆方组分别与全方比较，拆方1号海马、皮质区AchE活性降低，其蛋白水平升高程度与全方无明显差异，拆方2，3，4号则均与全方有统计学差异(P⟨0.05或P⟨0.01)；拆方2，3，4号与拆方1号比较，除拆方2号在提高海马区蛋白水平与拆方1号无明显差异外，其余各组均与拆方1号有统计学差异(P⟨0.05或P⟨0.01)。结论：拆方1号及全方改善AD模型小鼠学习记忆，抑制脑内AchE活性作用明显优于其他拆方组，两者疗效相当，且前者药味精简。

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种中枢神经元退行性病变，临床表现为进行性认知、语言及行为障碍，最终大脑皮质及皮质下功能丧失致患者死亡，其发病机制不明确，中医药是重要治疗手段之一[1]。院内制剂复方中药脑尔康胶囊(陕卫药制剂注字920138号)，由人参、黄芪、益智仁、何首乌、熟地黄、丹参、川芎、石菖蒲、冰片组成，益肾健脑、活血化瘀、补肾生髓，临床用于抗痴呆治疗多年[2]。但脑尔康药味繁多，如何研制出处方更精练，疗效较佳，符合现代中药特色的抗痴呆新药目前尚处在探索阶段。本文通过动物实验分析脑尔康拆方组对AD模型小鼠学习记忆障碍及大脑右侧皮质、海马中乙酰胆碱酯酶(Acetylcholine Esterase，AchE)活性的影响，以旨为创制新药提供实验依据。

1 材料与方法 1.1 动物与材料 清洁级小鼠70只，昆明种，雄性，体重30±2.8g(西安交大医学院实验动物中心提供，许可证号：SCXK(陕)08-004)。人参、黄芪、川芎、丹参、益智仁、熟地黄、何首乌、石菖蒲、冰片等生药饮片，西安交大第二医院药房提供；结晶氯化铝分析纯(AlCl3·6H2O)，天津津北精细化工有限公司提供；AchE测定试剂盒、蛋白定量测试盒、蛋白标准液均为南京建成生物工程研究所提供。

1.2 实验设备 跳台仪(西安交通大学医学院动物试验中心提供)，721E型可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司KJ0104102706)，台式离心机，低温冰箱。

1.3 实验方法 1.3.1 动物分组：70只小鼠适应性饲养7 d后分随机为7组：空白组、模型组、脑尔康全方组、拆方1号组(人参、川芎、熟地黄、冰片)、拆方2号组(黄芪、丹参、何首乌、石菖蒲)、拆方3号组(人参、丹参、何首乌、冰片)、拆方4号组(人参、丹参、益智仁、冰片)。小鼠随机分进各组，每组10只(在喂养及药物干预过程中有个别小鼠死亡)。在室温(22±2)℃、湿度40%～50%条件下自由进食饮水。

1.3.2 药品制备：按文献[3]，黄芪70g，熟地黄、何首乌各35g，人参、川芎、丹参、益智仁、石菖蒲各23g，冰片2.3g。传统水煎，使含生药1g/mL，各拆方组生药量同脑尔康全方，煎法相同，经115℃高压灭菌20min，4℃保存备用；AlCl3固体物粉末溶于双蒸水，浓度配制为10g/L，经0.25μm双层超滤膜过滤待用。

1.3.3 动物造模：按文献[4]，除空白组外，各组小鼠以AlCl3溶液100mg/kg腹腔注射，隔日1次，共40d，造成AD模型；空白对照组则以生理盐水0.5 mL腹腔注射，隔日1次，共40d。结束后采用跳台法进行学习记忆测试。

1.3.4 给药方法：学习记忆测试次日给药。空白组及模型组给予生理盐水0.5mL/d灌胃；经剂量估换计算，其余各组给予相应药物14.3g/kg/d剂量灌胃，共30d。结束后再次采用跳台法进行学习记忆测试。

1.3.5 学习记忆测试：采用跳台法，测试仪器为跳台仪，将被试小鼠放入其中，5 min后，将其放于测试仪器的平台上，当其跳下四肢接触铜栅时给予25 V 电压刺激。学习成绩的潜伏期为其逃至平台的时间(s)，学习成绩的错误次数为5 min 内触电次数。24 h 后再次进行测试，记忆成绩的潜伏期为再次跳下被电击的时间(s)，记忆成绩的错误次数为3 min 内触电次数。

1.4 观察指标 在冰面上准确分离海马及皮质后，分别称取海马及皮质组织重量，放入匀浆器中，加9倍生理盐水制成10%匀浆，4℃，3500r/min离心10min，取上清液用化学比色法测定AchE活性，同时测蛋白浓度。

2 结 果 2.1 铝盐对小鼠学习记忆的影响 见图1。与空白组比较，各组学习记忆错误次数及学习记忆潜伏期均有明显差异(P⟨0.05或P⟨0.01)。表明慢性铝中毒对各组小鼠学习记忆均造成一定障碍。

2.2 脑尔康拆方对AD模型小鼠学习记忆障碍的影响 见图2。①与模型组比较，全方、拆方1号学习与记忆错误次数明显减少(P⟨0.01)，各用药组学习潜伏期均明显缩短(P⟨0.05或P⟨0.01)，记忆潜伏期延长(P⟨0.01)；②与全方比较，拆方1号学习记忆错误次数及潜伏期与其无明显差异，拆方2，3，4号学习记忆错误次数、学习潜伏期与其存在明显差异(P⟨0.01)，拆方3，4号记忆潜伏期与其存在明显差异(P⟨0.01)，拆方2号记忆潜伏期与其无明显差异。表明拆方1号与全方在改善学习记忆障碍方面疗效较佳，且无明显差异。

2.3 脑尔康拆方对AD模型小鼠海马和皮质组织AchE活性及其蛋白水平的影响 见表1。①与空白组比较，模型组海马、皮质组织AchE活性均明显升高(P⟨0.01)，蛋白水平均明显降低(P⟨0.05或P⟨0.01)。②与模型组比较，全方、拆方1号海马、皮质组织AchE活性均明显降低(P⟨0.01)，其蛋白水平均明显升高(P⟨0.05或P⟨0.01)。③拆方2，3，4号海马、皮质组织AchE活性，蛋白水平均无明显差异。④与全方比较，拆方1号在促进脑蛋白的合成、抑制AchE活性方面与全方组无明显差异；拆方2，3号仅在促进脑蛋白合成与全方组无明显差异；拆方4号仅在促进海马区蛋白合成与全方组无明显差异。⑤与拆方1号比较，除拆方2号在海马区蛋白的生成与拆方1号无明显差异外，其余各组在促进其蛋白合成，抑制AchE活性方面均有显著性差异(P⟨0.05或P⟨0.01)；拆方2，3，4号各个组间比较，均无明显差异。

表1 脑尔康拆方对AD 模型小鼠脑内AchE活性及其蛋白水平的影响

注：与空白组比较，ΔP⟨0.05，▲P⟨0.01；与模型组比较，◇P⟨0.05，◆P⟨0.01；与全方组比较，□P⟨0.01；与拆方1号组间比较，■P⟨0.05，○P⟨0.01

3 讨 论 AD发病机制复杂，脑内胆碱能神经系统的退行性变被认为是造成AD的最重要病理因素之一。目前已公认[5]，学习记忆与中枢胆碱能神经系统关系极为密切，中枢胆碱能通路是构成学习记忆的主要通路。Ach是其中维持高级神经活动的一种重要神经介质，AchE的作用是水解Ach生成胆碱和乙酸，在终止神经传递中起着重要作用。近年来研究也进一步证明[6]，老化与AD病人脑组织AchE活性显著升高，造成Ach含量不足，导致中枢神经系统功能障碍，出现学习和认知能力下降甚至丧失。因此测定脑组织中AchE活性，可判断脑内Ach含量变化。铝能抑制胆碱的转运，促进乙酰胆碱的分解，降低神经乙酰胆碱转移酶的活性，提高脑内AchE活性。核酸和蛋白质是大脑记忆功能的物质基础，铝可能通过抑制脑组织蛋白质和核酸的合成而降低学习记忆功能[7]。

脑尔康中人参、黄芪为君药；益智仁、何首乌、熟地黄为臣药；丹参、川芎为佐药；石菖蒲、冰片为使药。本实验采用君臣佐使化裁法[8]进行拆方，结果显示，各拆方组均能不同程度改善慢性铝中毒致AD模型小鼠学习记忆障碍，抑制海马及皮质AchE活性，提高其蛋白水平。其中拆方1号及全方组作用明显优于其他拆方组(P⟨0.05或P⟨0.01)，两者疗效相当，但前者药味精简。拆方1号之所以能与全方组药效相当，可能与人参、川芎、熟地黄、冰片四味药物效果较强，药物间协同作用更强等有关。现代药理学证明，人参提取物主要成分人参皂甙Rb1能提高大鼠学习记忆能力，减轻AD大鼠海马及皮质神经元的Tau蛋白磷酸化水平，并能上调学习记忆相关蛋白表达[9]。刘长安等[10]研究证明，川芎嗪可降低大鼠原代海马神经元细胞高级糖化终产物受体(RAGE)的表达，有效抑制神经元活性氧产生，使海马神经元在Aβ的毒性作用下其细胞存活率上升，改善AD大鼠脑组织炎性，进而发挥其抗痴呆及神经保护作用。安红梅等[11]研究熟地黄可缩短D-半乳糖衰老模型大鼠Morris水迷宫中找到平台时间，提高模型大鼠脑组织SOD、NOS活性，减少MDA、LPO含量，减少SA-β-gal阳性表达细胞数，从而改善衰老模型大鼠学习记忆能力。

本实验旨在通过拆方研究减少复方制剂中的非药效因素，提高制剂水平，使复方脑尔康胶囊处方更为精简，疗效较佳，从而节约资源，降低成本，符合目前国内中药复方创制新药的常用方法和科研思路，为拆方后的新方进行毒理学和药效学研究打下实验基础，推动新药研究，促进中药发展。如何更好地融会贯通中医与现代医学的理论并将其用于指导中药方剂的拆方研究，如何通过更客观全面的观察指标分析拆方研究，有待进一步改进。

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(收稿2015-01-23；修回2015-03-05)

Experimental study on decomposing prescription of Naoerkang to effect the learning and memory and AchE activity in the brains of AD mice

The Psychology and Psychiatry department，the Second Affiliated Hospital of Xi’ an Jiaotong University (Xi’ an 710004)

Ma Xinxin Li Xi Tian Yuan et al

Objective：Decompose the Naoerkang to screen one decomposed prescription which has better effect but has fewer ingredients on Alzheimer’s Disease mice. Methods：70 mice were randomly divided into 7 groups，10 for each group，injected AlCl3solution into stomach to made the AD model. Mice of the control and the model groups had been forced to drink saline 0.5mL per day; and mice of the other groups had been forced to drink the response medicine，14.3g/kg per day，for 30 days. observed the learning and memory ability and AchE activity in right cortex and hippocampus in each mouse. Result：Compared with the model group，the whole group and decomposed 1 improved the learning and memory functions obviously(P⟨0.05 orP⟨0.01)，decreased the AchE activity obviously(P⟨0.01)，increased the protein level evidently(P⟨0.05 orP⟨0.01) in hippocampus and cortex. All of its decomposed prescriptions compared with the whole group，there were no significant differences existed in decomposed prescription 1 and the whole group，there were significant differences existed in decomposed prescription 2，3，4 and the whole group(P⟨0.05 orP⟨0.01). Compared with the decomposed prescription 1，there were significant differences (P⟨0.05 orP⟨0.01) existed in decomposed prescription 2，3 and 4 except for increasing the protein level in hippocampus of decomposed prescription 2. Conclusions：decomposed prescription 1 and Naoerkang groups both have better effect of improving the learning and memory functions and inhabiting the AchE activity than any other decomposed prescription，they have the same effect，but the former has fewer ingredients.

NaoErkang Alzheimer’s disease Learning and memory AchE activity Decomposing prescriptions

*陕西省科技发展攻关项目[2007K15-05(3)]

Δ通讯作者：西安交通大学医学院第二附属医院老年病科(西安710004)

▲第四军医大学西京医院检验中心(西安710032)

脑尔康 阿尔茨海默病 学习记忆 乙酰胆碱酯酶活性 拆方研究

R741

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.07.081