柴胡防治乙型肝炎的网络分子机理初探*

沈 霞 张 岗 陈 莹 陕西中医学院药学院 (西安 712046)

柴胡防治乙型肝炎的网络分子机理初探*

沈 霞 张 岗 陈 莹 陕西中医学院药学院 (西安 712046)

目的：乙型肝炎是危害我国人民健康的最主要疾病之一，中药柴胡防治乙肝疗效显著，然而其分子机理尚不清楚。本研究通过计算机辅助技术阐明柴胡防治乙型肝炎的分子机理及其作用靶点。方法：本研究通过数据库搜索得到乙肝病毒的靶点，在TCMSP数据库中筛选靶点与化合物，在PDB数据库中查询靶点的三维结构，利用Auto Dock软件对靶点和小分子进行对接打分，并通过Cytoscape软件构建网络模型。结果：研究发现Endoplasmic reticulum mannosyl-oligosaccharide 1,2-alpha-mannosidase靶点与柴胡中Dextrin Corn和GLB之间存在明显的相互作用；通过有效成分与靶点网络模型的构建阐明了柴胡有效成分防治乙肝的多成分对应对靶点的分子网络机制。结论：本研究揭示柴胡防治乙肝的物质基础、潜在靶点及分子网络机理，为研究开发中药防治乙肝新药提供理论基础。

乙型肝炎是危害我国人民健康的多发疾病之一，是由乙型肝炎病毒引起的疾病。感染乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)可引起肝炎、肝硬化甚至肝癌。我国是HBV感染的高发区，约有1.2亿HBV携带者，其中2000多万人为慢性乙肝患者。根据卫生部《2013中国卫生统计年鉴》统计，2012年我国病毒性肝炎发病数就达138.08万人，占法定甲、乙类传染病的第1位，排在病毒感染性疾病的首位，排在疾病死亡的第4位。HBV感染不仅给患者及其家庭造成巨大的经济和精神负担，而且给国家带来巨大压力。因此，开发研制新的特异性防治HBV的药物对我国具有重要的社会和经济效益。

传统中药防治肝病历来有之。柴胡为我国传统中药, 药用历史悠久。柴胡(Radix Bupleuri)为伞形科(Umbelliferae) 柴胡属( Bupleurum L.) 植物，始载于《神农本草经》，列为上品。属解表类中药，具有治疗肝郁气滞，疏肝解郁、升举阳气等作用[1]。在临床上柴胡及其复方一直用于肝病的预防和治疗[2]。然而，柴胡防治肝病的分子机制一直没有进行深入的研究。基于此，本研究以系统药理学的理论和方法为指导[3]，用乙肝病毒的蛋白靶点对柴胡中的主要有效成分进行虚拟筛选，并构建柴胡小分子与靶点的互作网络图。期望揭示柴胡防治乙肝的物质基础、潜在靶点及多成分多靶点的分子网络机制，为研究开发中药防治乙肝新药提供理论基础。

1 实验部分 1.1 数据的准备 从Drug bank数据库中搜索hepatitis B乙肝病毒的靶点。在TCMSP[4]数据库中搜索相应的柴胡化学成分。通过筛选，最终得到4个蛋白靶点：Chymotrypsinogen B(2CHA)、DNA gyrase subunit B(4GFN)、RAC-alphaserine/threonine-protein kinase(3096)。筛选得到的小分子化合物主要有：槲皮素、葛根素、糊精、月桂酸和莰非醇12种等。在PDB和NCBI中下载乙肝靶点的Endoplasmic reticulum mannosyl-oligosaccharide 1,2-alpha-mannosidase(1X9D)三维结构和柴胡化合物结构。

1.2 分子对接 采用Auto dock软件对柴胡中化合物分子去除水分子加上氢，接着处理Ligand，为其加上电荷，设置Root和可扭转的键。 参数采用默认值，遗传算法使用拉马克遗传法，可以通过软件将相应靶点分子和化合物构象载入窗口观察到对接情况，分析聚类构象，在receptor环境中可以观察对接构象并得出对接分值。

1.3网络模型的构建 将数据导入Cytoscape，建立网络结构。并分别用不同颜色表示靶点和化合物，本文中以深色圆点表示靶点，以浅色圆点表示化合物。

2 结果与讨论 利用筛选得到的4个靶点对柴胡中的12个化合进行虚拟筛选，最终发现靶点Endoplasmic reticulum mannosyl-oligosaccharide 1,2-alpha-mannosidase和柴胡中的Dextrin Corn、GLB分子对接结果最为合理，靶点与分子间的结合能Binding Energy分别为-3.96和-6.64。对接图中表明(图1左)，Dextrin Corn分子距离靶点中的氨基酸残基GLU283、SER282、GLU273、LYS275、LYS655、TRP284较近。在Dextrin Corn分子周围有许多己电离的极性氨基酸残基，这些残基与Dextrin Corn分子之间所形成的静电作用对复合物的稳定起重要作用。同样(图1右)，GLB与靶蛋白氨基酸残基ARG334、ARG597、GLU599、PHE649、GLU689、THR688、PRO598距小分子较近。在GLB分子周围有许多己电离的极性氨基酸残基，这些残基与GLB分子之间所形成的静电作用对复合物的稳定起重要作用。这一研究首次找到并证实了柴胡小分子防治乙肝的主要作用靶点。

图1 柴胡中Dextrin Corn、GLB与靶点Endoplasmic reticulum mannosyl-oligosaccharide 1,2-alpha-mannosidase对接示意图

将筛选所得4个靶蛋白与12个柴胡化合物导入Cytoscape构建的网络模型如图2所示：其中深色的为蛋白质靶点，浅色的为化合物。临床中广泛利用小柴胡汤治疗慢性乙型肝炎, 表明小柴胡汤联合抗病毒药物治疗慢性乙肝具有改善肝功能和清除血清标志物的作用[5-6]。从图中可以看出柴胡12种化学成分与4种蛋白质靶点形成了复杂的网络关系，从分子角度展示柴胡防治乙肝的多成分对应多靶点的网络机制。此外，与靶蛋白RAC-alphaserine/threonine-protein kinase(3096)发生作用的化合物种类最多。表明在柴胡防治乙肝病毒中，这一靶点是柴胡作用的主要靶点。

图2 柴胡多成分多靶点的分子网络模型

3 结 论 中药多成分-多靶点的作用模式一直是中药研究的热点和难点。本论文用计算机软件研究乙肝作用靶点与柴胡有效成分的相互作用，从理论上筛选与乙肝靶点有互作的柴胡有效成分，首次阐明了柴胡防治乙肝的物质基础及对应靶点。本研究构建网络模型展示柴胡防治乙肝多成分多靶点的作用关系。柴胡化学成分复杂多样，通过分子网络模型可以很好的阐释其在治疗乙肝的过程中的复合效应。不同成分作用于同一个靶点时其效果可能会叠加，也可能会相互抵消，这有待于进一步的实验考证。本文通过计算机模拟实验对靶点和药物成分进行筛选，构建网络模型阐明柴胡在治疗乙肝的物质基础、潜在的靶点及分子网络，为阐明中药复杂的作用机制提供技术方法，同时为开发中药防治乙肝新药提供理论基础。

[1] 中华人民共和国卫生部药典编辑委员会.中华人民共和国药典[M]． 北京: 人民卫生出版社，2010: 263．

[2] 杨 柳,王雪莹.北柴胡化学成分与药理作用的研究进展[J].中医药信息,2012,29(3):143-145.

[3] 王永华,杨 凌.基于系统药理学的现代中药研究体系[J].世界中医药,2013,8(7):801-809.

[4] 汝锦龙，李 鹏，汪纪楠，等 ．TCMSP: a database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines ：Journal of Cheminformatics ，2014 Apr 16 ：6(1):13.

[5] 黄幼异,黄 伟,孙 蓉.柴胡皂苷对肝脏的药理毒理作用研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2011,17(17)：789-791.

[6] 陈丹丹,龚作炯.小柴胡汤治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的临床研究 [J]. 现代中西医结合杂志， 2011 ，20(31)：384-386.

(收稿2014-07-08;修回2014-08-09)

*陕西省科技厅自然科学基金(2014JQ4148)

肝炎，乙型/中医药疗法 柴胡/治疗应用 分子机理

R512.62

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.01.054