神经肽B在中枢神经系统中的免疫荧光表达

郁阿翠 黄俊山 曾雪爱

·基础研究·

神经肽B在中枢神经系统中的免疫荧光表达

郁阿翠 黄俊山 曾雪爱

目的 研究神经肽B(NPB)在大鼠脑组织中的定位，探讨NPB与睡眠的关系。方法 采用免疫荧光法测定NPB在除嗅球、垂体及小脑以外大鼠脑组织中的表达。结果及结论 NPB不仅表达于于下丘脑腹内侧核、背内侧核、弓状核、视交叉上核和未定带腹侧区及中脑的腹侧被盖区，中缝背核，黑质等区域，还见于基底前脑的VDB和HDB；内、外侧苍白球，尾状核；丘脑网状核；脑干的中缝隐核、中缝核、前被盖核、横纹肌核、旁正中网状核、巨细胞网状核。

神经肽B；免疫荧光；脑立体定位

神经肽B(NPB)是2002年Fuji等[1]从牛的下丘脑中提取鉴定出来的G蛋白耦合受体7(GPR7)和G-蛋白耦合受体8(GPR8)的内源性配体，NPB及其受体在中枢神经系统及外周组织均有广泛存在，参与调节了摄食和能量平衡、神经内分泌及炎性反应疼痛，近年还发现其参与了睡眠与应激情绪和行为的调节。功能与组织分布具有密切的关系。为了更深入的研究NPB与睡眠的关系，本文通过免疫荧光测定了除嗅球、垂体及小脑以外的大鼠脑连续切片，发现NPB阳性细胞不仅存在于下丘脑腹内侧核、背内侧核、弓状核、视交叉上核和未定带腹侧区[2-3]及中脑的腹侧被盖区，中缝背核，黑质等区域[3]，还见于基底前脑的VDB和HDB；内、外侧苍白球，尾状核；丘脑网状核；脑干的中缝核、中缝隐核、前被盖核、横纹肌核、正中网状核、巨细胞网状核。为进一步研究NPB与睡眠的关系提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 6只SD雄性大鼠，体重220～250 g，购自福建医科大学实验动物中心[实验动物许可证号SCXK(闽)2012-0001]。

1.2 设备及试剂 冰冻切片机(CMl900，Leica)；荧光倒置相差显微镜(DMI3000，Leica)；-20 ℃冰箱(伊莱克斯，型号BCD-182K)；Neuropeptide B Antibodies(Pierce Biotechnology公司)；Alexa Fluor@488标记山羊抗兔IgG(重链+轻链，北京中杉金桥生物技术有限公司)；10%正常羊封闭血清(福州硕博生物技术有限公司)，免疫荧光染色二抗稀释液(碧云天生物技)；抗荧光淬灭封片液(强，碧云天生物技术公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 标本处理 实验大鼠经10%水合氯醛按0.3 mL/100 mg麻醉后迅速开胸，先使用200 mL 0.1 mol/L PBS溶液从主动脉灌流，后采用4 ℃的4%多聚甲醛先快后慢外固定。冰上迅速分离脑后，置于4%多聚甲醛过夜，然后移至30%蔗糖溶液中脱水。等组织沉底后，在液氮中速冻1 min，利用冰冻切片机切片，30 μm/片，收集切片到冻存液中备用。

1.3.2 NPB免疫荧光染色 将组织切片从冻存液中取出放入12孔板孔中，用0.01 PBS磷酸盐缓冲液洗5遍，每次10 min；10%正常羊封闭血清37 ℃封闭90 min；NPB抗体(1∶500)，4 ℃孵育48 h后用0.01PBS磷酸盐缓冲液洗5遍，每次10 min；Alexa Fluor@488标记山羊抗兔IgG(重链+轻链，1∶200)孵育2 h；0.01PBS磷酸盐缓冲液洗5遍，每次10 min；DAPI染色液常温染色5 min，0.01PBS磷酸盐缓冲液洗3遍，每次5 min；将组织切片转移到载玻片上用抗荧光淬灭封片液(强)封片，倒置荧光显微镜下拍片。以上3个步骤注意避光。

图像采集使用DMI3000，Leica的荧光倒置相差显微镜，参考脑立体定向图谱(Paxinos和Watson)分析单侧神经核团从腹侧向背侧的所有阳性神经元表达分布情况。

2 NPB阳性细胞在大鼠脑组织中分布

2.1 基底前脑 NPB阳性细胞在基底前脑斜角带水平支臂核(HDB)和斜角带垂直支臂核(VDB)的分布，见图1A-B。

图1 NPB阳性细胞在基底前脑的分布

注：A、NPB阳性细胞在基底前脑斜角带水平支臂核(HDB)的分布。B、NPB阳性细胞在基底前脑斜角带垂直支臂核(VDB)的分布。

2.2 苍白球及其附近组织 NPB阳性细胞在内外侧苍白球有中等数量分布，而在其附近的丘脑网状核(Rt)及下丘脑未定带区(ZI)有相对更多数量的分布，见图2 A-B。

图2 NPB阳性细胞在苍白球及其附近组织的分布

注：(A)中等数量的NPB阳性细胞存在于外侧苍白球(LGP)。(B)在内侧苍白球(MGP)也有数量较多的NPB阳性细胞存在，但在丘脑网状核(Rt)和下丘脑未定带区(ZI)观察到更多数量。

2.3 下丘脑 NPB阳性细胞在下丘脑多个部位均有存在，如下丘脑外侧区(LH)，弓状核(Arc)(图3A、D)，未定带区(ZI)(图2B)均可见中等数量的NPB免疫阳性细胞。更有大量的NPB阳性细胞存在下丘脑室旁核(PaLM、PaMP)和视上核(SO)，而在下丘脑视周核(Pe)仅有零星分布(图3B、C)。在正中隆起的内外层(MEE、MEI)也有NPB阳性细胞的分布，见图3D。

图3 NPB阳性细胞在下丘脑的分布

注：(A)中等数量的NPB阳性细胞存在于下丘脑外侧区(LH)。(B)在下丘脑室旁核(PaLM、PaMP)有数量较多的NPB阳性细胞存在，而在下丘脑视周核(Pe)仅有离散分布。(C)NPB阳性细胞在视上核(SO)的分布。(D)NPB阳性细胞在弓状核(Arc)及正中隆起的内外层(MEE、MEI)分布，细胞形态较视上核及视旁核的细胞小。

2.4 脑干 实验发现，NPB阳性细胞不仅见于中脑腹侧被盖区(VTA)、中缝背核(DR)、黑质(SN)及埃-韦斯特法尔核(EW核)，见图4A-D。在脑干其他部位，也存在NPB阳性细胞，如脑干的中缝正中核(MnR)、中缝旁正中核(PMnR)、中缝隐核(Rob)、脑桥网状核嘴侧部(PnO)、前被盖核(Atg)、横纹肌核(Rbd)、旁正中网状核(PMn)、巨细胞网状核(Gi)，见图4E-I。另外，在蓝斑(LC)大细胞中也有NPB蛋白的表达，见图5。

3 讨论

已有多项研究证明具有调节能量代谢和内分泌功能的神经肽一般也具有调节睡眠的作用，如食欲肽[4-5]、神经肽S[6-7]、神经肽Y[8]等。2011年Hirashima等[9]在光、暗两个时相分别给侧脑室注射NPB，发现在暗时相NPB减少了小鼠自发活动，脑电及肌电测定也显示在该时相NPB，增加慢波睡眠(SWS)，而异相睡眠并未受影响，并且NPB诱导的慢波睡眠的光谱功率与生理性的。但是NPB通过何种途径调节睡眠还不是很清楚。结构和功能是密切相关的，本实验发现NPB免疫阳性细胞在下丘脑、脑干及基底前脑的多个核团均有表达。

图4 NPB阳性细胞在脑干的分布

注：(A)NPB阳性细胞在埃-韦斯特法尔核(EW核)的分布。(B)在维管束间核(IF)未见明显NPB免疫阳性细胞存在，在腹侧被盖区(VTA)及PN核有少量NPB阳性细胞分布。(C)在黑质(SN)，NPB阳性细胞主要分布在黑质背层(SNCD)及黑质内侧部(SNM)，在黑质网状部(SNR)及黑质外侧部(SNL)也有分布。(D)NPB阳性细胞在中缝背核(DR)、中缝正中核(MnR)、中缝旁正中核(PMnR)、前被盖核(Atg)、横纹肌核(Rbd)的分布。(E)NPB阳性细胞中缝正中核(MnR)、中缝旁正中核(PMnR)的分布。(F)NPB阳性细胞在脑桥网状核嘴侧部(PnO)的离散分布。(G)NPB阳性细胞在中缝隐核(Rob)、旁正中网状核(PMn)、巨细胞网状核(Gi)的分布。(H)及(I)显示高倍镜下NPB免疫阳性细胞在中缝隐核(Rob)、旁正中网状核(PMn)、巨细胞网状核(Gi)的分布。

图5 NPB阳性细胞在蓝斑的分布，其细胞形态多呈纺锤形

觉醒依赖于脑干网状结构上行激活系统的激活，该系统经中脑分为两支，一支经过丘脑，另一支经下丘脑外侧区和基底前脑到达皮层，研究发现脑干网状结构-丘脑-皮层通路在觉醒维持中的作用较小，主要是脑干网状结构-下丘脑外侧区和基底前脑-皮层发挥作用[10]。NPB在网状核的分布提示其是脑干网状结构的组成部分，另外其在下丘脑、基底前脑的分布，提示可能参与脑干网状结构上行激活系统的调节，在以后的实验中可以通过局部注射NPB或是其激动剂、抑制剂，再通过神经束路示踪技术观察NPB的神经传导通路，另外还可以通过脑电、肌电观察判断这些核团中的NPB对睡眠的具体影响。研究发现在中脑的腹侧被盖区(VTA)，黑质(SN)区均有NPB阳性细胞存在，且与酪氨酸羟化酶阳性神经元(可能为多巴胺能神经元)共表达[11]。研究表明酪氨酸羟化酶和食欲素受体在VTA广泛共表达[12]。那么在中脑，NPB是否与食欲素受体有直接的联系，这种假设还有待进一步的研究证实。

慢性睡眠剥夺作为一个应激源可激活HPA轴[13-14]，研究发现慢性睡眠剥夺会导致肥胖的发生，可能的方式是通过增加摄食，降低基础代谢率及增加胰岛素抵抗等[15]。NPB具有调节下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)皮质轴的作用[16]，同时还可增加抵抗素的分泌和表达[17]。下丘脑外侧区被称为“摄食中枢”，损毁或者高频电刺激该区均可以减少食物的摄取致体重的下降[18]。本实验发现NPB在下丘脑外侧区的分布，提示其可能与慢性睡眠剥夺后的能量调控有关。

睡眠剥夺常伴发情绪障碍，如焦虑、紧张、易怒[19]，中缝核是5-HT能神经元的密集区，具有调节情绪、压力及协调社会关系的作用，NPB在中缝背核，中缝隐核、中缝核的分布提示其可能参与睡眠障碍伴发的情绪障碍的发生及发展。

目前关于NPB在睡眠中的研究还较少，其在睡眠调控区域的广泛分布预示着其可能参与睡眠调节的多个过程，加深对NPB在睡眠调控中的认识，有助于为深入研究机体对睡眠与觉醒的调节机制寻找一个切入点。

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Neuropeptide B immunofluorescence in the central nervous system of the rat

YU Acui, HUANG Junshan, ZENG Xueai.

Fujian Academy of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350003,China

Objective To study the expression of NPB in the rat brain,in order to further research the relationship between NPB and sleep.Methods With the use of an antiserum directed against the rat NPB, immunofluorescence to NPB was detected in several discrete areas of the central nervous system except the olfactory bulb,pituitary and cerebellum of serial section in this article.Results & Conclusion I found that NPB immune positive (irNPB) cells not only prenst in the hypothalamic (ventromedial nucleus, dorsal medial nucleus), arcuate hypothalamic nucleus,supraoptic nucleus and zona incerta, The ventral tegmental area, dorsal raphe nucleus, substantia nigra and so on of the midbrain , they also were found in the basal forebrain (VDB and HDB), globus pallidus(lateral,medial), caudate putamen (striatum), reticular thalamic nucleus, median raphe nucleus, raphe obscurus nucleus, anterior tegmental nucleus, rhabdoid nucleus, paramedian reticular nucleus and gigantocellular reticular nucleus.

Neuropeptide B; G-protein coupled receptors; Sleep; Stress

国家自然科学基金项目(编号：81173149，81202845)；福建省中医药研究院自主选题项目(编号：2013fjzyyk-1)

350003福州，福建省中医药研究院

黄俊山，E-mail：hjsh0825@163.com