都匀毛尖对小鼠肝脏CYP3A酶活性及其mRNA水平的影响*

王筑婷， 李红梅， 雷霆雯

(贵阳医学院 生物化学与分子生物学教研室， 贵州 贵阳 550004)



都匀毛尖对小鼠肝脏CYP3A酶活性及其mRNA水平的影响*

王筑婷， 李红梅， 雷霆雯**

(贵阳医学院 生物化学与分子生物学教研室， 贵州 贵阳 550004)

目的： 研究绿茶对细胞色素P450 3A(CYP3A)酶活性及其mRNA水平的影响，推测绿茶对药物代谢的作用。方法： 绿茶选用都匀毛尖，120只昆明种雄性小鼠随机分为4组，对照组正常饮食饮水，低、中、高剂量绿茶组分别予0.25 g/(kg·d)、0.5 g/(kg·d)、1.0 g/(kg·d)都匀毛尖茶汤灌胃，分别在1周、2周、3周时处死小鼠，测定小鼠肝脏微粒体CYP3A的活性，并用RT-PCR技术检测小鼠肝脏中CYP3A11 mRNA水平。结果： 都匀毛尖能抑制CYP3A酶活性，呈时间-剂量依赖性；都匀毛尖可抑制CYP3A11mRNA表达，且呈时间-剂量依赖性。结论： 都匀毛尖对CYP3A的酶活性及mRNA水平均呈时间-剂量依赖性抑制作用，提示都匀毛尖可能通过影响CYP3A酶活性对药物的代谢发挥作用。

绿茶；细胞色素P450；酶活性；代谢解毒，药物

细胞色素P450酶是细胞色素P450(cytochrome P450，CYP450)基因超家族编码形成的一组酶蛋白[1]，哺乳动物CYP450可分为3类，其中微粒体CYP450是主要的一类，由多个基因家族组成(CYP1、CYP2、CYP3、CYP4、CYP17、CYP19、CYP21)。CYP3A是CYP450酶系中最主要的一类，近一半药物都经过CYP3A代谢，CYP3A一方面能催化药物发挥药效，另一方面加速药物清除[2]。因此CYP3A的活性可用于研究药动学、药物或毒物的代谢、药物相互作用、药物代谢酶的遗传多态性及疾病与代谢酶的相互影响。茶叶原产于中国，我国的产茶区遍及全国19个省区、1 000余个县市，全世界有160多个国家都在饮茶[3]。作为保健品，绿茶较多地保留了鲜叶内的天然物质[4]，对其研究多集中于提取物儿茶素或茶多酚，绿茶对CYP3A的酶活性有何影响尚未见报道。本研究观察都匀毛尖的茶汤对CYP3A酶活性及mRNA表达的影响，以了解其对药物代谢的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

都匀毛尖(散装，购于都匀毛尖茶直销专卖店)。昆明种雄性小鼠(贵阳医学院动物中心)，体质量(30±3)g。Bradford蛋白质定量试剂盒(北京天根生物技术有限公司)、氨基比林、NADP+、6-磷酸葡萄糖二钠、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、焦碳酸二乙酯 (DEPC)、Trizol、氯仿/异戊醇(24∶1)、异丙醇、PCR扩增试剂、琼脂糖(均购于上海生工生物工程技术服务有限公司)，cDNA第一链合成试剂盒、DNAGREEN绿如蓝低毒核酸染料(均购于北京天恩泽基因科技有限公司)、DNA Marker (FERMENTAS公司)、RT-PCR引物(上海生工生物工程技术服务有限公司合成)，CYP3A11引物：上游为5′-TGACAAACAAGCAGGGAT-3′，下游为5′-CTGGTGAATGTGGGGGAC-3′、β-Actin引物：上游为5′-TGCGTTTTACACCCTTTC-3′，下游为5′-AGTCCTCAGCCACATTTG-3′。

1.2 方法

1.2.1 绿茶的制备 分别将1.5 g、3 g、6 g 绿茶加入100 mL沸水中，浸泡30 min，用两层纱布过滤，即得低剂量组(0.25 g/kg)、中剂量组(0.5 g/kg)及高剂量组(1 g/kg)茶汤，灌胃准备[5]，所用茶汤均每日现配。1.2.2 动物分组 雄性昆明种小鼠120只，随机分为1个对照组及3个实验组，每组30只。实验组分为低剂量组(0.25 g/kg)、中剂量组(0.5 g/kg)及高剂量组(1 g/kg)，对照组正常饮食饮水，各实验组每日给予各自浓度茶汤灌胃后正常饮食饮水，灌胃量为0.5 mL，每日灌胃一次，连续灌胃1周、2周、3周后每组各处死动物10只。

1.2.3 制备微粒体 钙沉淀法制备微粒体悬液，按照文献[6] 操作。肝微粒体蛋白质浓度测定用Bradford蛋白质定量试剂盒，按照说明书操作。

1.2.4 CYP3A酶活性的测定 通过测定红霉素N-脱甲基酶活性反映CYP3A酶活性,具体操作按照文献[7]进行。

1.2.5 CYP3A11基因转录水平检测 肝组织总RNA的提取，按Trizol试剂说明书提取肝组织总RNA，沉淀用RNase-free H2O溶解，测定260 nm和280 nm时的 OD值，判断RNA的纯度，计算RNA浓度，按cDNA第一链合成试剂盒说明书合成cDNA[8]。PCR扩增体系总体积25 μL，预变性94 ℃ 4 min，变性94 ℃ 30 s，退火51 ℃ 1 min，延伸72 ℃ 1 min，终末延伸72 ℃ 7 min，30个循环[9]。制2%琼脂糖凝胶，每100 mL凝胶加8 μL DNAGREEN， 0.5×TBE电泳缓冲液、100 V电压电泳50 min，琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，在凝胶成相分析系统上照相观察结果并记录，计算CYP3A11基因与β-Actin基因扩增条带表达量像素灰度的比值作为mRNA表达的相对水平。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 CYP3A酶活性

随着绿茶作用时间的延长和剂量的增大， CYP3A的酶活性逐渐降低。各组比较后差异有统计学意义，P<0.01。见图1、表1。

图1 都匀毛尖对各组小鼠肝微粒体CYP3A酶活性的影响Fig.1 Effect of Duyun Mao Jian Tea on enzymatic activity of CYP3A of mice liver microsome

表1 都匀毛尖灌胃不同时间对小鼠肝微粒体CYP3A酶活性的影响Tab.1 Effect of Duyun Mao Jian Tea at different concentrations on enzymatic activity of CYP3A of mice liver microsome at different time points

(1)与对照组比较，P<0.01；(2)与用药1周组比较，P<0.01；(3)与用药2周组比较，P<0.01；(4)与低剂量组比，较，P<0.01；5)与中剂量组比较，P<0.01

2.2 CYP3A11 基因的RT-PCR分析

随着绿茶作用时间的延长和剂量的增大， CYP3A11 mRNA的表达逐渐降低。各组比较差异有统计学意义(P<0.01)。见图2、表2。

3 讨论

微粒体CYP450与NADPH-CYP450氧化还原酶及脂质双层共同构成混合功能氧化酶系(mixed function oxidase system ,MFOS)，负责药物、致癌物、环境化合物、一些内源性生成物的生物转化作用[10]。CYP450的抑制和诱导可改变一些药物、环境化合物、前致癌物等在体内的代谢[11]。在所有的CYP450酶中，CYP3A因含量丰富及底物范围广泛而具有相当的重要性，约有40%～50%的药物在人体的代谢都经由CYP3A催化。因此CYP3A酶活性增高，药物的代谢速率加快、半衰期缩短、血药浓度降低，常规剂量给药常不能取得预期临床疗效；酶活性降低，则药物清除率降低、半衰期延长、易出现药物蓄积引起的各种药物不良反应。因此CYP3A活性的研究，可为预测最佳给药剂量以达到提高药物治疗效果、减少不良反应的目的。CYP3A代谢的药物主要有硝苯地平、红霉素、特非那丁、咪达哇苯妥英、美替沙仑、皮质激素、环孢霉素、地西泮和嗅派醇酮等。CYP3A家族中在成人肝脏参与药物代谢的主要是CYP3A4，在小鼠体内，参与药物代谢的CYP3A亚系包括CYP3A11、CYP3A13、CYP3A16、CYP3A25、CYP3A41、CYP3A44、CYP3A57、CYP3A59等，其中CYP3A11是含量最丰富也是最重要的亚型之一，占肝脏中CYP450总含量的20%以上[12]。由于CYP3A家族担负了大部分药物及人体内源性物质的代谢，因此当其活性受到影响，会引起这些药物在体内的代谢发生改变或影响药效，或蓄积而引起中毒现象及发生药物副作用。

注：“对”为对照组，L1、L2、L3 分别为毛尖低剂量1周组、2周组、3周组，M1、M2、M3分别为毛尖中剂量1周组、2周组、3周组，H1、H2、H3分别为毛尖高剂量1周组、2周组、3周组

表2 都匀毛尖灌胃不同时间对小鼠CYP3A11 mRNA表达的影响Tab.2 Effect of Duyun Mao Jian Tea at different concentrationson the mRNA expressions of CYP3A11 of mice liver microsome at different time points

(1)与对照组比较P<0.01；(2)与用药1周组比较P<0.01，(3)与用药2周组比较P<0.01；(4)与低剂量组比较P<0.01，(5)与中剂量组比较P<0.01

本实验结果显示，都匀毛尖呈时间-剂量依赖性抑制CYP3A的酶活性，同时也使CYP3A11 mRNA的表达呈时间-剂量依赖性降低 ，说明都匀毛尖可能是通过降低CYP3A11转录水平来使酶活性受到抑制的，因此由CYP3A代谢的药物如与都匀毛尖茶汤同时使用可能会使这些药物在体内的代谢减慢，长期使用可能会造成蓄积甚至中毒，引起一些不良的药物反应。

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(2015-02-25收稿，2015-03-15修回)

中文编辑： 周 凌；英文编辑： 刘 华

医学名词术语使用规范

名词、术语应统一，不要一义多词或一词多义。妇产科学、耳鼻咽喉科学、血液病学、呼吸病学、内分泌学、眼科学和外科学的名词已由医学名词审定委员会审定公布，应严格执行，其它尚未审定者，目前以下列2个主题词索引为准：(1)《医学主题词注释字顺表中文索引》(中国医学科学院医学信息研究所)；(2)《中医药主题词表》(中国中医研究院图书情报研究所)。在这2个主题词表中找不到者，则以人民卫生出版社出版的《英汉医学词汇》、化学工业出版社出版的《药名词汇》和科学出版社出版的各学科名词审定本为准。如“发烧”应改为“发热”，“红血球”应改为“红细胞”，“血色素”应改为“血红蛋白”，“剖腹产术”应改为“剖宫产术”等。国内尚无统一译名的，参考以上词典慎重拟定，并在译名后加括号加注外文，在医学名词审定委员会正式公布后，应立即严格遵照执行。

《贵阳医学院学报》编辑部

Effect of Duyun Mao Jian Tea on Enzymatic Activities and mRNA Expression of CYP3A in Mouse Liver

WANG Zhuting, LI Hongmei, LEI Tingwen

(DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China)

Objective: To study the effects of green tea (Duyun Mao Jian tea ) on enzymatic activity and mRNA expression of cytochrome P4503A(CYP3A)in mouse liver and to analyze its effect on drug metabolism. Methods: Kunming male mice were randomly divided into four groups. Control group was given food and water as normal, and the other three groups were were given Duyun Mao Jian tea-soup at doses of 0.25 g/(kg·d), 0.5 g/(kg·d) and 1 g/(kg·d) by gavage respectively for 3 consecutive weeks at most. The mice were killed at 1stweek, 2ndweek and 3rdweek respectively and the mice liver microsome were extracted. Then the enzymatic activity of CYP3A was determined by spectrophotography. RT-PCR was adopted to detect mRNA expression levels of CYP3A11. Results: Duyun Mao Jian Tea could inhibit the enzymatic activity of CYP3A not only time-dependently but also dose-dependently. Meanwhile, Duyun Mao Jian Tea inhibited the mRNA expression of CYP3A11 not only time-dependently but also dose-dependently. Conclusions: Duyun Mao Jian Tea can inhibit the enzymatic activity and mRNA expression of CYP3A not only time-dependently but also dose-dependently, indicating that Duyun Mao Jian tea can affect drug metabolism by inhibiting enzymatic activity of CYP3A and in turn may result in some side-effect.

green tea; cytochrome P450; enzyme activity; metabolic detoxication, drug

贵阳医学院院基金(K2009-9)

时间：2015-05-21

http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150521.1316.032.html

R34-33; R969.1

A

1000-2707(2015)05-0471-04

**通信作者 E-mail:leitw@sina.com