环介导等温扩增法与临床常规方法检测淋球菌效果比较

邓鹏程，邝满元，王岐本，张如胜

（1.湘南学院基础医学部解剖教研室，湖南郴州423000；2.长沙市疾病预防控制中心，湖南410001）

环介导等温扩增法与临床常规方法检测淋球菌效果比较

邓鹏程1，邝满元1，王岐本1，张如胜2

（1.湘南学院基础医学部解剖教研室，湖南郴州423000；2.长沙市疾病预防控制中心，湖南410001）

目的将环介导等温扩增（LAMP）法与涂片及细菌培养法2种临床常规检测淋球菌的方法进行比较研究，探讨LAMP法用于快速诊断淋球菌感染的可行性。方法同时采用LAMP法与涂片及细菌培养2种方法，对2011年10月至2013年8月长沙市疾病预防控制中心性病门诊疑似淋菌感染患者86例的生殖道分泌物进行检测，并对3种检测方法分别获得的阳性结果进行分析。结果运用LAMP法检测得到淋球菌阳性率[91%（78/86）]高于涂片法[60%（52/ 86）]和细菌培养法[53%（46/86）]，差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论使用LAMP法检测淋球菌具有快速、简便、直观、特异、敏感及不需要特殊仪器等优点，有望成为一种新型实用的淋球菌核酸检测手段。

奈瑟球菌，淋病； 基因扩增； 培养技术； 涂片

淋病是淋病奈瑟菌（简称淋球菌）引起的以泌尿生殖系统化脓性感染为主要表现的性传播疾病，其发病率高居我国性传播疾病第2位。比较不同的淋球菌检测方法并研发快速、高效的诊断方法，对于患者能进行及时有效的治疗和避免其在人群中快速传播均意义重大。针对淋球菌的检测，临床常规检测采用的是涂片法和细菌培养法。2010年国内学者崔亚利等[1]以淋球菌标准菌株基因组DNA为模板，进行环介导等温扩增（LAMP）法扩增，成功建立了检测淋球菌基因的LAMP法，为淋球菌的快速检测提供了新的手段。为了比较用LAMP法和临床常规方法检测淋球菌的效果，本研究组同时运用这3种技术对86例疑似淋菌感染患者的泌尿生殖道分泌物进行检测，检测过程及结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源 本组研究对象为2011年10月至2013年8月在长沙市疾病预防控制中心性病门诊就诊的86例泌尿生殖系统感染患者。入选标准：曾有不洁性生活史且尿道口或生殖道有明显的脓性分泌物，经主治医师以上级别的医生诊断疑为淋病患者，其中男56例，女30例；年龄18～58岁。

1.1.2 标本采集

1.1.2.1 女性患者 月经干净后10～14 d，将采样无菌棉拭子（常规检查一般用生理盐水浸湿的棉拭子取材）置于阴道深部或阴道后穹隆转动并停留10～30 s取分泌物。

1.1.2.2 男性患者 将采样无菌棉拭子深入到距离男性患者尿道口2～3 cm处，轻轻转运并停留10～15 s取出带有黏膜细胞的脓性分泌物。

1.2 方法

1.2.1 涂片法 将淋病患者的泌尿生殖道分泌物标本涂片经革兰染色后，在显微镜下观察多核白细胞，其内有革兰阴性双球菌出现诊断为阳性。

1.2.2 细菌培养法 标本采集后立即分区接种于经室温（25℃）平衡的选择性培养基中，接种后的平皿置于35～36℃、5%CO2和湿度大于70%的培养箱内进行24～28 h菌株培养，再通过半自动细菌鉴定仪对标本进行鉴定。

1.2.3 LAMP法 LAMP检测采用深圳博睿祥辉生物技术有限公司生产的通用型LAMP反应液试剂盒，标本DNA提取和LAMP扩增均按试剂盒说明书进行，主要操作步骤为：反应模板DNA提取，将棉拭子采集的标本置于1mL生理盐水的无菌离心管中浸泡10min，管内壁挤干丢弃，离心10min，弃上清液，加入终质量浓度0.1 g/L蛋白酶K和终浓度1%十二烷基磺酸钠（SDS），55℃水浴60min，酚氯仿法提取目标基因。引物设计，利用Primer-ExplorerV3软件设计淋球菌16S rRNA基因的引物，16S rRNA是16S核糖体rRNA基因，其特点是稳定，在细胞内含量较高，具有特异性和敏感性。16S rRNA：F3 GCGGTGGATGATGTGGATT，B3 CCGGCAGTCTCATTAGAGTG，FIP CTCCTCCGTCTCCGGAGGATTCGATGCAACGCGAAGAACCT，BIP TCGTCAGCTCGTGTCGTGAGAT-CCCAACCGAATGATGGCA，LF CGCACATGTCAAAACCAGGTA，LB GTTGGGTTAAGTCCCGCAACG。LAMP扩增反应体系建立：引物BIP和FIP各2μL，F3及B3各0.2μL，LF和LB各1μL，10mmol/L的dNTPs 4μL，5mol/L的betaine4μL，160mmol/L的MgSO41μL，10×BstDNA Polymerase Buffer2.5μL，BstDNA Polymerase8 U，DNA模板 2μL，加双蒸水（ddH2O）至反应液为25μL，置于恒温（65℃）水浴箱经60min完成扩增反应，后将其迅速置于80℃水浴箱反应2min终止反应。加SYBRGreen 1μL，肉眼观察颜色变化，扩增产物检测管变绿为淋球菌阳性，扩增产物检测管呈现棕色则为淋球菌阴性。取扩增产物1.5μL经3%琼脂糖凝胶电泳，观察扩增产物有无梯状条带出现判断结果，检测管扩增产物经电泳后呈梯状条带为淋球菌阳性，而检测管扩增产物经电泳后未出现梯状条带为淋球菌阴性。

1.3 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件进行数据分析，计数资料以率表示，两组间比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

LAMP技术检测的淋球菌阳性率明显高于涂片及细菌培养法，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 3种淋球菌检测方法结果

3 讨 论

淋病是由淋球菌所引起的一种泌尿生殖道黏膜传染性疾病，淋病的病原菌为淋球菌，是一种革兰阴性双球菌，呈卵圆或肾形，成对排列。淋病潜伏期为2～10 d，在临床上有5%～2%的男性和60%的女性感染后可无明显症状，如不及时诊断与治疗，常诱发不孕不育症、性功能障碍及其他各种并发症。淋病通过性接触直接传染，也可通过患者分泌物污染物及医疗器械间接传染，特别是幼女常通过间接途径感染，新生儿可通过患淋病母亲的产道感染，引起淋菌性结膜炎，如延误治疗，可能导致失明。淋病在人群中的快速传播极其严重的危害不容忽视，开发快速准确的淋球菌检测方法意义重大。

目前临床上较常用的淋球菌检测法是涂片和细菌培养法，男性急性淋病直接涂片检测到多形核白细胞内革兰阴性双球菌即可成立诊断，不足之处是对慢性患者灵敏度较低，而女性阴道分泌物中杂菌多，大大降低了敏感性和特异性，阳性率不高且有假阳性。培养出淋球菌是诊断淋病的重要佐证，细菌培养法对症状很轻或无症状的男性及女性患者都是较好的方法，只要培养阳性就可确诊，但培养法耗时且很受患者用药影响。细菌培养法是世界卫生组织推荐淋球菌的标准检测方法，但在临床工作中，用细菌培养法检测淋球菌受到操作技术、菌株存活环境、检测时间、试剂质量以及患者在检测前是否使用过抗生素等因素的限制[2]。

20世纪90年代以来，随着分子生物学技术的发展，PCR检测技术逐渐被运用于淋球菌的实验室检验中，根据淋球菌的特异基因序列设计引物，对淋球菌进行PCR检测逐渐成为传统的涂片和淋菌培养法的协助诊断方法。PCR法具有灵敏度高，特异性强，不断应用于临床标本的检测，但针对淋球菌性淋病的PCR仍有一些限制，比如，费用昂贵、污染的风险、不能提供抗生素抵抗的信息等。此外，还有序列相关性限制，尤其是假阳性结果是一个主要需要考虑的问题[3]。因此，需要新的检测技术，LAMP法是2000年Notomi等[4]报道的一种新型核酸扩增技术，其针对靶序列上的特异区域设计引物，用具有链置换活性的DNA聚合酶快速扩增目的基因片段，形成大量具有大小不等茎环结构的基因片段。其特异性强，快速高效扩增，在30～60min内扩增出109～1010倍的目的基因，扩增速度比传统PCR高出2～3个数量级，LAMP反应还产生大量白色的焦磷酸镁沉淀，肉眼观察即可见沉淀，加SYBRGreen 1μL后反应管颜色明显变化，扩增产物检测管变绿为阳性，扩增产物检测管呈现棕色则为阴性。取扩增产物1.5μL经2%～3%琼脂糖凝胶电泳，观察扩增产物有无梯状条带出现即可判断结果，检测管扩增产物经电泳后呈梯状条带则为阳性，检测管扩增产物经电泳后未出现梯状条带则为阴性，结果易于鉴定，LAMP扩增反应在恒温下即可进行，只需一台恒温箱，不要需昂贵的设备，操作简单方便而耗时少[5]。近年来，国内外许多科研工作者[6-8]，应用LAMP技术成功对炭疽芽孢杆菌、肺炎链球菌、结核分枝杆菌等细菌类病原微生物进行检测，而且通过对众多细菌研究结果表明，与传统PCR相比，LAMP法不仅快速、敏感，而且具有良好的特异性[9]。

本研究采用LAMP法对淋球菌特有16S rRNA基因设计引物，进行快速扩增检测淋球菌，通过对比3种检测方法得出：运用LAMP法、涂片及细菌培养法检测到的淋球菌阳性率分别为91%、60%和53%，用LAMP法检测的淋球菌阳性率明显高于涂片及细菌培养法。与PCR技术相比，新型的LAMP法无需昂贵、精密的PCR仪器设备，也不需要DNA的热变性、长时间的温度循环以及一级产物后续检测等步骤，LAMP法更为快速，而且操作简便，检测成本更低。

在实验个程中，本研究组对淋球菌检出阳性患者进行追踪回返，发现经过抗淋球菌治疗后，患者疾病都有明显好转或痊愈，从而最大可能避免假阳性的出现。

综上所述，LAMP法与临床常用的涂片和细菌培养法相比，具有更高检出率，可大幅度降低漏诊且不受患者用药影响，使用LAMP法检测淋球菌具有快速（1 h）、简便（只需要1台普通恒温水箱）、直观（肉眼可以观察结果）、特异、敏感及不需要特殊仪器等优点，为淋球菌的快速准确检测提供了一种新的手段，有望成为临床上淋球菌常规检测的简便方法，特别是对条件不理想的基层疾控和医疗机构淋病检测的普及具有重要意义。

参考文献

[1]崔亚利，何於娟，刘鑫，等.快速检测淋球菌porA和16S rRNA基因的环介导等温扩增技术的建立[J].中国生物制品学杂志，2010，23（10）：1125-1128.

[2]陈秀英.应用细菌培养法与PCR检测法检测淋病奈瑟氏菌的对比研究[J].求医问药，2012，10（5）：236-238.

[3]周炳可.淋球菌PCR检测技术研究进展[J].中国卫生检验杂志，2008，18（4）：763-765.

[4]Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et al.Loop-mediated isothermal amplification ofDNA[J].Nucleic AcidsRes，2000，28（12）：e63.

[5]李文桂，陈雅棠.环介导等温扩增技术用于细菌检测的研究现状[J].热带医学杂志，2013，13（11）：1423-1428.

[6]Dugan L，Bearinger J，Hinckley A，etal.Detection of Bacillus an thracis from spores and cells by loop-mediated isothermal amplification without samplepreparation[J].JMicrobiol Methods，2012，90（3）：280.

[7]Kim DW，Kilgore PE，Kim EJ，etal.The enhanced pneumococcal LAMP assay：A clinical tool for the diagnosisofmeningitis due to Streptococcus pneumoniae[J].PLoSOne，2012，7（8）：e42954.

[8]于霞，梁倩，马易峰，等.环介导等温扩增技术快速检测痰标本中结核分枝杆菌的初步评价[J].中国实验诊断学，2013，17（5）：846-849.

[9]孙菲，鲁少平，成英，等.环介导等温扩增技术研究进展[J].中国国境卫生检疫杂志，2013，36（6）：417-420.

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.07.037

：B

：1009-5519（2015）07-1057-03

2014-09-20

2014-11-10）

2010年湖南省高等学校科学研究项目（10C1240）。

邓鹏程（1975-），男，湖南桂阳人，硕士研究生，讲师，主要从事分子寄生虫学、解剖教学与研究；E-mail：dpch333@163.com。