胆红素对小鼠小胶质细胞BV-2分泌NO及细胞因子的影响

关小勇，高 干，杨兴兴，陈华干，于桥爱，李雪丽（柳州市妇幼保健院检验科，广西545001）

胆红素对小鼠小胶质细胞BV-2分泌NO及细胞因子的影响

关小勇，高 干，杨兴兴，陈华干，于桥爱，李雪丽
（柳州市妇幼保健院检验科，广西545001）

目的探讨胆红素对小鼠小胶质细胞BV-2分泌NO及细胞因子的影响。方法体外培养小鼠小胶质细胞系BV-2，加入不同浓度非结合胆红素刺激，空白对照组非结合胆红素浓度为0μmol/L，实验组分别为50、100、200μmol/L，观察在不同浓度非结合胆红素刺激下NO的产生情况；于胆红素孵育的不同时间点（分别为2、4、8、12 h）收集细胞上清液，利用 ELISA法检测细胞培养上清液中白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平。结果胆红素含量为0～100μmol/L时，NO生成量呈增加趋势，50、100、200μmol/L胆红素浓度组NO生成量均高于对照组，且100、200μmol/L组高于50μmol/L组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。随着胆红素刺激作用的延长，IL-6、TNF-α水平均有所增加，孵育4、8、12 h后IL-6、TNF-α水平均高于孵育2 h，且孵育8、12 h的IL-6、TNF-α水平与孵育4 h比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；孵育8 h后，IL-6、TNF-α水平趋于稳定，且孵育8 h与12 h比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结论胆红素可能通过多条信号传导途径刺激小鼠小胶质细胞BV-2分泌NO及细胞因子，在这些通路中实施干预可能成为治疗新生儿高胆红素血症的途径之一。

胆红素； 小神经胶质细胞； 一氧化氮； 细胞因子类； 小鼠

胆红素是体内含卟啉的化合物如血红蛋白、肌红蛋白等的代谢产物，主要以结合胆红素和非结合胆红素的形式存在[1]。新生儿高胆红素血症是由于血中胆红素水平增加所导致，是新生儿常见病、多发病。我国不同程度新生儿黄疸的发生率在90%以上，且近年来呈增加趋势，其中绝大多数是以血清非结合胆红素水平升高为主[2-3]。新生儿高胆红素血症可引起胆红素脑病，严重者甚至遗留神经系统后遗症[4-6]。神经小胶质细胞是神经胶质细胞的一种，约占全部胶质细胞的5%，相当于脑和脊髓中的巨噬细胞，是中枢神经系统（CNS）中的第一道也是最主要的一道免疫防线。正常情况下，小胶质细胞不停地清除CNS中损坏的神经、斑块及感染性物质，维护CNS的稳定。本文使用小鼠小胶质细胞研究小胶质细胞BV-2在非结合胆红素作用下释放NO及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）的情况，探讨胆红素引起神经细胞损伤的机制。

1 材料与方法

1.1 材料 小鼠小胶质细胞系BV-2（上海桥社生物科技公司），二甲基亚砜（美国Sigma公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程有限公司），RPMI-1640基础培养液（Gibco公司），胆红素（Fluka公司），清蛋白（Sigma公司），NO检测试剂盒（南京建成生物工程研究所），IL-6、TNF-α试剂盒（博士德生物科技公司），上海科华酶标仪和全自动洗板机（ELISA法）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 复苏BV-2细胞，置于RPMI-1640培养液（含10%胎牛血清，100U/mL青霉素，100U/mL链霉素）中，于37℃、5%CO2培养箱中培养，根据细胞代谢情况，1～2 d换液，至指数生长期备用。

1.2.2 硝酸还原酶法检测胆红素对小胶质细胞产生NO的影响 取指数生长期的细胞配制成细胞悬液，用细胞计数板计算细胞数，加入RPMI-1640培养液制备成5×105mL-1的细胞悬液，分别接种于24孔板中，每孔1mL，设空白对照组（胆红素浓度为0μmol/L），不同胆红素浓度组（50、100、200μmol/L），待细胞贴壁后，加入各浓度胆红素孵育8 h后，检测NO的生成量，按照NO检测试剂盒说明书操作。

1.2.3 ELISA法检测胆红素对IL-6、TNF-α的抑制作用 取指数生长期的细胞配制成5×105mL-1的细胞悬液，分别接种于24孔板中，每孔1mL。待细胞贴壁后，每孔加入胆红素浓度为100μg/mL后，分别于0、2、4、8、12 h后收集细胞培养上清液，ELISA法检测IL-6、TNF-α的含量。按照相应试剂盒说明书进行操作。

1.3 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件进行数据分析。计量资料以±s表示，采用t检验；多个样本间的两两比较使用单方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 硝酸还原酶法检测胆红素对小胶质细胞产生NO的影响 胆红素含量为0～100μmol/L时，NO生成量呈增加趋势，胆红素浓度50、100、200μmol/L组NO生成量[（55.67±12.10）、（79.40±17.09）、（78.98±20.42）pg/mL]均高于对照组[（34.33±15.89）pg/mL]，且100、200μmol/L组高于50μmol/L组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；但200μmol/L组与100μmol/L组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 胆红素对小胶质细胞IL-6、TNF-α产生的影响 随着胆红素刺激作用的延长，IL-6、TNF-α的生成量均有所增加，孵育4、8、12 h后IL-6、TNF-α的生成量均高于2 h，差异有统计学意义（P＜0.05）；孵育8、12 h与孵育4 h比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；孵育8 h后IL-6、TNF-α的生成量趋于稳定，且孵育8 h与12 h比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 胆红素作用下小胶质细胞IL-6、TNF-α水平的变化（±s，pg/mL）

表1 胆红素作用下小胶质细胞IL-6、TNF-α水平的变化（±s，pg/mL）

注：与孵育2 h比较，aP＜0.05；与孵育4 h比较，bP＜0.05。

孵育时间2 h 4 h 8 h 12 h TNF-α IL-6 53.20±11.53 159.33±16.01a102.65±17.09ab93.45±20.42ab33.66±16.84 202.67±26.10a427.84±75.22ab396.75±19.62ab

3 讨 论

胆红素是血红蛋白的终末代谢产物，属于非酶类抗自由基系统。有研究发现，低浓度的血清胆红素是重要的自由基清除剂，对机体有保护作用，正常新生儿血中胆红素水平显著高于成年人和年长儿，可弥补其酶类抗自由基的不足，这可能是新生儿黄疸的生理意义[7]。高浓度血清胆红素有显著的细胞毒性，不仅可引起CNS不可逆的损伤，而且对机体免疫系统功能也有影响。胆红素对神经细胞有毒性作用，浓度过高可显著抑制免疫系统功能，使黄疸患儿易于感染，加重病情。认识胆红素的免疫作用，对于高胆红素血症患儿的治疗有重要意义[8]。作为脑内主要的免疫效应细胞，小胶质细胞具有类似巨噬细胞的功能，在受到刺激时易被激活，分泌大量的炎症细胞因子。NO虽然是多种生理功能的重要调节分子，大量NO是造成神经细胞损伤死亡的重要炎症因子之一，可导致宿主细胞和邻近细胞的损伤[9-10]。在胆红素等多种神经毒性物质刺激下，NO生成量增加。因此，直接抑制NO的产生，可能是治疗炎症的有效手段之一。从胆红素作用后IL-6、TNF-α的产生情况来看，胆红素可引起小胶质细胞的炎性反应，其可能是通过多条信号传导途径，如转录因子、丝裂原活化蛋白激酶等，最终诱导 NO、IL-6、TNF-α等炎症因子产生[11]。在这些通路中实行干预，是新生儿高胆血症治疗时的手段之一，而具体作用机制，还需进一步研究探讨。

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The effects of bilirubin on the secretion of NO and cytokines in themurinem icroglial cells BV-2

Guan Xiaoyong，Gao Gan，Yang Xingxing，Chen Huagan，Yu Qiaoai，Li Xueli
（Department of Clinical Laboratory，Liuzhou Municipal Maternity and Child Health CareHospital，Guangxi545001，China）

ObjectiveTo approach the effectsofbilirubin on the secretion of NO and cytokines in themurinemicroglia cellsBV-2.MethodsThemurinemicroglia cell line BV-2 were cultured in vitro，adding different concentrationsofunconjugated bilirubin for stimulation.The concentrations of the control group and the experimental group were set as 0μmol/L and 50，100，200μmol/L accordingly.Itwas observed the production ofNO under the stimulation of different concentration unconjugated bilirubin.Itwascollected the cellssupernatantatdifferent time pointsof2nd，4th，8th，and 12th hour for the detection of IL-6 and TNF-αconcentrationsby ELISA assay.ResultsThe production contentof NOwasorientated to increasewhen the bilirubin ranged 0-100μmol/L.The production contentofNO in the experimentalgroupwith bilirubin concentration being 50μmol/L，100μmol/L，200μmol/Lwas higher than thatof the control group，in which，The production contentof NO in the experimental group with bilirubin concentration being 100μmol/L，200μmol/Lwashigher than thatwith 50μmol/L group，the difference had statisticalsignificance（P＜0.05）.With the prolongingofbilirubin stimulation，the concentrationsof IL-6 and TNF-αwere increased. The concentration of IL-6 and TNF-αafter the incubation for 4h，8 h and 12 h washigher than those for 2 h.Compared the concentration of IL-6 and TNF-αthe incubation for8 h，12 h and 4 h respectively，the difference had statisticalsignificance（P＜0.05）. After8-h incubation，the concentrations of IL-6 and TNF-αwas tended to be stable.Therewasno statistical significance between the incubation for 8 h and 12 h（P＞0.05）.ConclusionBilirubinmay stimulate themurinemicroglial cells BV-2 to secrete NO and cytokinesviamultiple signal transduction pathways.The implementation of the intervention in these pathwaysmightbe one of the treatmentmethodsofneonatalhyperbilirubinemia

Bilirubin； Microglia； Nitric oxide； Cytokines； Mice

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.07.004

：A

：1009-5519（2015）07-0967-02

2014-11-11）

广西壮族自治区卫生厅自筹经费项目（Z2013601）。

关小勇（1969-），男，广西梧州人，副主任医师，主要从事临床生物化学与免疫学研究；E-mail：gxy6688@163.com。

李雪丽（E-mail：xuelyly@163.com）。