伊拉地平对MPP+损伤PC12细胞保护作用的实验研究

李 俊，王训翠，李庆林

(1．安徽中医药大学;2．省部共建新安医学教育部重点实验室，安徽合肥 230038)

帕金森病(PD)是一种以黑质纹状体区多巴胺能神经元进行性缺失和纹状体多巴胺含量显著减少为特征的中枢神经系统变性疾病。据统计，到2030年，世界范围内50岁以上人群中，将会有930万人受困扰［1－2]。常用于PD动物模型的试剂有1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)、鱼藤酮(rotenone)、百草枯、6-羟基多巴(6-OHDA)［3]。其中MPTP在体内代谢为1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)后，进入线粒体，抑制氧化呼吸链复合体I(complex I)酶的活性，致使多巴胺能神经元氧化应激损伤。因此，MPP+损伤细胞建立帕金森病体外模型的实验方法已获得公认［4]。

在帕金森病患者中，特有的现象是SNc多巴胺能神经元中线粒体复合酶I活性明显下降［5]。线粒体膜电位(ΔΨm)的变化会影响线粒体膜通透性转运孔，改变线粒体跨膜电位和线粒体的形态，并能增加细胞膜通透性，引起细胞能量代谢障碍。细胞内活性氧的产生90%左右来自于线粒体，文献报道也证实氧化应激与线粒体途径的细胞死亡关系密切［6]。

伊拉地平是一种新型的二氢吡啶类钙通道阻滞剂。有研究显示，伊拉地平在帕金森病动物模型中具有保护作用［7]，可延缓、甚至中止帕金森病病情。本实验研究探讨伊拉地平对MPP+损伤PC12细胞的保护作用及作用机制的研究。

1 材料与方法

1．1 药品与试剂 ISR(批号:111213)获赠于安徽省新星药物开发有限责任公司，纯度99．0%;噻唑蓝(MTT):Amersco进口分装，武汉生命技术有限公司;DMEM:Gibco公司;胎牛血清(fetal bovine serum，FBS):美国Hyclone公司;PBS:北京中杉生物技术有限公司;1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+):Sigma公司。

1．2 实验细胞 PC12细胞株购自中国科学院上海细胞生物学研究所。

1．3 方法

1．3．1 MTT法检测细胞存活率 培养细胞用DMEM培养液配制2×108·L－1细胞悬液，100 μL每孔接种于96孔板。实验设置正常对照组，MPP+处理组，MPP++ISR组，每组6个复孔。置37℃，5%CO2细胞培养箱中过夜后，按分组要求给与不同浓度药物处理，培养24 h后，每孔加5 g·L－1的 MTT溶液10μL，37℃下继续孵育4 h后，除去培养液，加入150μL DMSO，低速震荡10 min，充分溶解蓝色结晶。以酶标仪490 nm波长下检测每孔吸光度值。细胞活性以与正常对照组相比的百分数表示。

1．3．2 细胞内活性氧水平检测 取对数生长期的细胞以2×109·L－1接种培养于6孔板，实验分组与处理同前，培养48 h后，胰酶消化，离心(1 500 r·min－1，5 min)收集各组细胞，细胞重悬于终浓度为10μmol·L－1的二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯(2＇，7＇-dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA)不含血清的培养液中，吹匀，避光条件下培养20 min，荧光强度使用流式细胞仪(激发波长488 nm，发射波长525 nm)检测。

1．3．3 JC-1检测线粒体膜电位(MMP) 收集各组细胞，加入终浓度为5 mg·L－1JC-1染液，于37℃、5%CO2培养箱孵育20 min，以800 r·min－1低速离心5 min，去上清，培养基清洗3次，细胞重悬，继续培养20 min，上流式细胞仪检测。

1．4 统计学处理 实验数据均以均数±标准差(x±s)表示，多组间数据比较采用单因素方差分析，两组间数据比较采用 t检验，并且用 SPSS 17．0软件包进行处理，P＜0．05被认为有统计学意义。

2 结果

2．1 ISR对MPP+损伤的PC12细胞存活率的影响 如图1所示，随着MPP+浓度的升高，细胞存活率逐渐下降，MPP+浓度为1 mmol·L－1时，细胞生长明显受到抑制，与正常对照组比较，MPP+组细胞存活率为(56．4 ±7．1)%(P ＜0．01);0．5 ～2 μmol·L－1ISR对MPP+损伤的PC12细胞具有保护作用，并呈一定的量效依赖性。因此，以1 mmol·L－1MPP+作为最佳造模浓度，以2μmol·L－1ISR作为最佳给药剂量，见图1。

2．2 伊拉地平对MPP+诱导的PC12细胞ROS的影响 与正常对照组比较，1 mmol·L－1MPP+处理PC12细胞24 h后，荧光强度明显增强，提示细胞内ROS生成明显升高，2μmol·L－1伊拉地平处理组荧光强度明显低于MPP+组，结果表明伊拉地平能够抑制MPP+诱导的ROS生成。见图2。

2．3 伊拉地平对MPP+损伤的PC12细胞线粒体膜电位的影响 实验结果显示，1 mmol·L－1MPP+处理PC12细胞24 h后，线粒体膜电位显著降低，2 μmol·L－1伊拉地平预处理后，线粒体膜电位升高。结果提示伊拉地平可能通过阻止线粒体膜电位的下降而抑制线粒体损伤的发生。见图3。

3 讨论

帕金森病发病的核心环节之一是线粒体功能障碍。线粒体膜电位是反应线粒体内膜通透性的主要标志［8]，线粒体膜通透性转换孔(mitochondrial permeability transit pore，MPTP)的开放将导致线粒体膜电位降低。本研究结果表明，与正常对照组相比，模型组线粒体膜电位显著降低，伊拉地平预处理后线粒体膜电位显著升高。此研究结果提示神经毒物MPP+引起线粒体MPTP开放，降低线粒体膜电位，伊拉地平能够阻止这一损伤的发生。

氧化应激是中枢神经系统受损后继发性损害的主要机制。脑缺血缺氧，ROS生成增多，氧化系统与氧化应激失衡，最终导致细胞死亡［9]。正常情况下，神经组织内ROS的消除和生成处于动态平衡状态;在病理状态及环境因素刺激下，ROS生成过多或干扰抗氧化防御系统功能，破坏这种动态平衡，触发神经细胞的兴奋毒性导致神经元的死亡［10]。因此，在神经退行性疾病防治中清除氧化应激因子或抑制氧化应激的发生具有重要意义。本实验结果表明，与正常对照组相比，MPP+引起细胞内ROS的升高，ISR能抑制MPP+诱导的细胞内ROS的增加，表明ISR对受损细胞的保护作用可能与改善线粒体氧化应激有关。

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