小篮子法测定植物种子呼吸速率的方法改进

李海霞， 徐久玮， 蔡明历， 曾汉来， 王学奎

(华中农业大学 植物科学技术学院 作物学国家级实验教学示范中心， 武汉 430070)

小篮子法测定植物种子呼吸速率的方法改进

李海霞， 徐久玮， 蔡明历， 曾汉来， 王学奎

(华中农业大学 植物科学技术学院 作物学国家级实验教学示范中心， 武汉 430070)

利用CO2红外气体分析仪对测定植物种子CO2呼吸速率的小篮子法进行了改进。结果表明：改良小篮子法操作简便，可实时监测数据变化，测定的实验数据准确度较高,变异系数较小，在一定程度上克服了传统小篮子法的缺陷，使实验测定更具科学性和严谨性，可用于本科生植物生理学实验教学。

呼吸速率；小篮子法；方法改进；实验教学

在华中农业大学本科生的《植物生理学实验》课程中开设了利用小篮子法(又称广口瓶法、碱吸收法、碱中和法、化学滴定法)对植物种子呼吸速率进行测定的实验内容。

测定种子呼吸速率的方法有多种，其中常用的有微量定容测压法[1-2]和小篮子法[3-9]。微量定容测压法测定种子呼吸速率的原理是在恒温和恒体积的条件下，用压力变化测定O2的消耗量，一般利用的仪器是微量呼吸检压计[10]。但此法的缺点是所用样品体积小, 取样要求精细, 过程较繁琐，若操作技术欠熟练, 误差较大。小篮子法测定种子呼吸速率的原理是用碱液吸收在单位时间内呼吸产生的CO2，再利用酸碱中和滴定原理滴定剩余的碱液，由空白和样品二者消耗的酸溶液之差即可计算出呼吸过程中释放的CO2的量[10]。由于只需要简单装置，因而小篮子法适用性较广，但其缺点是在实验操作过程中难以避免会有外界CO2的侵入和干扰，人为和客观影响因素较多，致使测定结果精确度较差。

随着中国科学技术的进步，现已开发出价格适中、适合教学的IRGA。为克服传统小篮子法测定植物种子呼吸速率的缺陷，本实验利用IRGA对其进行改进，进一步提高实验测定的科学性和严谨性，以期利用先进仪器设备提升本科生植物生理学实验教学水平。

1 材料和方法

1.1 实验材料

本实验选取适量油菜、小麦和玉米种子用清水分别浸种12 h、24 h和24 h(中间换水1次)，将浸泡好的种子平铺在瓷盘中，用湿毛巾覆盖催芽，以刚露芽为宜。

1.2 实验方法

1.2.1 传统小篮子法测定种子呼吸速率

参照王学奎[10]的方法，设计2.5 g、5.0 g和10.0 g 3个不同种子用量的处理，反应时间分别为10 min、20 min和30 min，每个处理重复3～5次。

状态3 在iP(t)反向的时刻(即等效电流源iP(t)在零点的时刻),电路进入状态3。压电电容CP上充满了电,此时同步开关闭合,并联电感L和压电电容CP形成L-C振荡回路,将电容上的电压在这一时刻进行反向,待L-C振荡结束后,CP上的电压完成反向,同步开关及时断开。至此,状态3结束。

式中，Vo为空白滴定用去的草酸量(mL)，Vs为样品滴定用去的草酸量(mL)，W为样品鲜质量(g)，t为测定时间(h)，1为每毫升1/44 mol/L的草酸相当于1 mg CO2，44为CO2的相对分子量(g/mol)。

1.2.2 改良小篮子法测定种子呼吸速率

设计2.5 g、5.0 g和10.0 g 3个不同种子用量以及2 min、4 min、6 min、8 min和10 min 5个不同反应时间的处理，对于10.0 g种子用量的处理再增加15 min和20 min 2个反应时间。每个处理重复3～5次。利用CB-1101光合蒸腾作用测定系统(北京雅欣理仪科技有限公司)检测种子呼吸产生的CO2量的变化，采取闭路测量方式进行测定：将流量计与仪器面板上的“IN1”和“OUT1”接气嘴相连，碱石灰管与“IN”和“OUT”接气嘴相连，调节流量计流速为0.6 L/min，进行CO2分析器调零；完成调零后取下碱石灰管，用一根硅胶管将“IN”和“OUT”接气嘴相连，封闭此段气路。把称重后的测试材料放入一个500 mL广口瓶内，瓶口用打有两孔的橡皮塞塞紧，用硅胶管与仪器的“IN2”和“OUT2”接气嘴相连，先平衡2 min，再开始测量：先按“参/初”键，再按“测/终”键，记下CO2初始浓度值(μL/L)，到了测定时间(面板上有计时器)，记下CO2最终浓度值(μL/L)，测量结束时按下“完成”键，再重复上述步骤即可开始下一次测量。在开始测量之前，先向各接口处吹气来检查是否漏气，以保证气路的密封性良好。

式中，V为反应体积(L)，ΔC为CO2浓度差值(μL/L，为CO2最终浓度值与初始浓度值的差值)，W为样品鲜质量(g)，t为测定时间(h)，24.5为25℃时标准大气压下的气体摩尔体积(L/mol)。

1.2.3 温度控制

将装有材料的广口瓶放在水浴锅中保温，以维持瓶内反应温度为25℃。

1.2.4 统计分析

用Excel2003进行数据处理，并用SPSS16.0统计分析软件进行显著性差异分析。

2 结果与讨论

本实验采用传统和改良小篮子法测定油菜、小麦和玉米3种作物萌发种子的CO2呼吸速率，使用3个不同种子用量，每种处理各重复3～5次。传统小篮子法测定的结果见表1，改良小篮子法测定的结果见表2、表3。

表1 传统小篮子法测定萌发种子的CO2呼吸速率

**—显著性差异(P<0.01)。

由表1可看出，同一种作物不同种子用量的呼吸速率差异较大，且呼吸速率随种子用量的增加而降低，3种作物的表现趋势一致。统计分析表明传统小篮子法的同种作物不同种子用量间的呼吸速率差异达到极显著水平、变异系数也较大，实验结果精密度差、测定值偏高。

在改良小篮子法中，连好气路后先平衡2 min，之后再隔2 min、4 min、6 min、8 min和10 min各测定1次，对于10.0 g种子用量的在15 min和20 min时再各测定1次。结果表明(表2)：同一作物不同反应时间、不同种子用量间的ΔC比较稳定且随种子用量的增加而增大(资料未显示)，呼吸速率比较稳定。同种作物不同反应时间的呼吸速率差异不显著，小麦和玉米的2.5 g与5.0 g、10.0 g这2个种子用量间的呼吸速率差异达到显著水平，而油菜不同种子用量间的呼吸速率无显著性差异。在10.0 g种子用量的测定中(表3)，除玉米外，油菜和小麦的呼吸速率在反应时间超过10 min后都随时间延长而呈现下降趋势，且反应时间为15 min和20 min的呼吸速率与其它反应时间的差异达到显著水平。这是因为广口瓶内氧气量有限，随着呼吸作用的进行，氧气量越来越少，导致不能满足种子呼吸作用的需要。呼吸速率越小，氧气可供应的时间就越长(如玉米)。此外，改良小篮子法测定的呼吸速率的变异系数较小，实验结果更真实可靠。

表2 改良小篮子法测定萌发种子的CO2呼吸速率

*—小麦和玉米的2.5 g与5.0 g、10.0 g这两个种子用量间的呼吸速率具有显著性差异(P<0.05)。

表3 改良小篮子法测定10.0 g萌发种子的CO2呼吸速率

*—显著性差异(P<0.05)；**—显著性差异(P<0.01)。

通过分析操作步骤及实验原理，对造成这两种方法实验结果差异的影响因素进行比较(表4)。由此可见，传统小篮子法中Vo和Vs只有一个终点值，而没有中间值，不能实时监测化学反应的进行情况，也不能根据测试材料的呼吸速率特性判断适宜的反应时间。传统小篮子法易造成误差的影响因素比改良小篮子法多，即便是规范操作，也难以避免会有外界CO2的侵入和干扰，且种子用量越少，受影响的程度越高。而改良小篮子法则在一定程度上克服了传统方法的缺陷，可实时监测ΔC数据变化，便于确定测试材料的最佳测定时间，且在一定时间内(10 min)测定呼吸速率都较稳定，使实验测定更紧密、实验数据更可靠。

表4 两种测定方法实验结果差异的影响因素比较

3 结论

本实验对测定植物种子CO2呼吸速率的传统小篮子法进行了改进，改良小篮子法的实验结果更准确可靠。采用改良小篮子法(500 mL体积)测定种子呼吸速率的最适种子用量为5 g左右，最适反应时间控制在10 min之内，对于呼吸速率较小的材料则可适当延长反应时间。小篮子法的缺点是易受测试容器(广口瓶)体积的限制而易将氧气消耗完，若测试材料的呼吸速率较大，则可选用较大体积的广口瓶或减少种子用量。此外，若受实验条件限制只能采用传统小篮子法测定呼吸速率，建议种子用量要尽量大，可减少实验误差。

改良小篮子法测定的实验数据变异系数较传统方法小，操作简便，可实时监测数据变化，人为和客观影响因素较少，准确度较高，适用于大批量样品的测定，这些优点使其能更好地为科研服务并可应用于植物生理学实验教学实践，有利于学生掌握新的技术手段，培养学生的科学性和严谨性。

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Improved method for measuring respiratory rate of plant seeds using small-skep-method

LI Hai-xia, XU Jiu-wei, CAI Ming-li, ZENG Han-lai, WANG Xue-kui

(National Experimental Teaching Demonstration Centre of Crop Science, College of Plant Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

The small-skep-method measuring CO2respiratory rate of plant seeds was improved utilizing CO2Infrared Gas Analyzer. The results showed that the modified small-skep-method was simple in operation and could monitor the data changes real-timely. Compared with the traditional method, the experimental data measured by the modified method had higher accuracy, and the coefficient of variation was smaller. The modified small-skep-method could overcome the defects of the traditional method to some extent, and make more scientific and rigorous experimental determination, so which can be used for undergraduate plant physiology experimental teaching.

respiratory rate; small-skep-method; improved method; experimental teaching

2014-08-25；

2014-09-24

2010年校级重点课程建设项目(植物生理生化实验系列课程)；2013年第三批国家级精品资源共享课立项项目(本科教育课程：植物生理学，序号796)

李海霞，实验师，博士，从事植物生理生化实验教学与管理， E-mail:lihx2011@mail.hzau.edu.cn；

王学奎，副教授，博士，从事植物生理学与基础生物化学教学与研究，E-mail: wang-xuekui@mail.hzau.edu.cn。

Q945.3

B

2095-1736(2015)01-0100-03

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2015.01.100