水培对中国红豆杉(Taxuschinensis)根系结构及生理生化的影响

卢 鹏， 龚一富

(宁波大学 海洋学院， 浙江 宁波 315211)

水培对中国红豆杉(Taxuschinensis)根系结构及生理生化的影响

卢 鹏， 龚一富

(宁波大学 海洋学院， 浙江 宁波 315211)

为了缓解红豆杉种质资源匮乏的现状和提高人工种植的红豆杉品质，试验运用水培技术，利用赤霉素(GA3)处理诱导水培红豆杉生根，通过比较水培与土培中国红豆杉在根系结构、叶片色素含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性、过氧化物酶(POD)、丙二醛(MDA)含量等部分指标的区别，揭示水培对红豆杉根系结构及生理生化的影响，探索从土培到水培转化过程中的变化规律。结果表明： 400 mg/L GA3处理能显著促进水生根的形成；水培红豆杉洁白光滑，侧根少，无根毛，在显微结构上，细胞紧凑，缺少维管柱细胞，有发达的通气组织；水培红豆杉叶绿素含量低于土培组，但SOD、CAT、POD活性均高于土培组(P<0.01)，MDA含量无显著区别，表明红豆杉从土培到水培转变过程中，部分形态及生理生化指标会发生改变来适应新环境，说明水培可以影响红豆杉的根系结构、色素含量以及部分抗氧化能力。实验为红豆杉的大规模无土栽培提供科学的理论依据。

水培; 红豆杉; 显微结构; 生理生化

水培技术，又称非固体介质栽培技术，其原理是在不改变植物遗传物质的基础上，通过外源激素或环境胁迫等方式激发原有生根基因的表达，促使其形成新根，后因水环境的诱导，迫使植物为适应低氧环境而改变原有的土生根系结构，分化出能适应新环境的水生根系，同时形成特有的生理生化与分子机制，最终实现在水中长期正常生长[1-2]。因水培技术具有节省土地，不受场地及自然条件限制等众多优势，在人工调控下提供植物最佳的生长环境，既可少量繁殖，也能大规模批量生产，已在园艺类植物繁育上得到应用。如郑蓉等[3]、Rao等[4]通过水培技术成功使马尾松穗条和百祖杉插条生根。近年来研究者开始研究水培栽培对植物形态结构和生理生化的影响。如王文泉等[5]，孙彦军等[6]报道了在低氧条件下，乳酸脱氢酶被激活，乳酸发酵使细胞质酸化，后激活乙醇发酵，导致乙烯含量的积累，乙烯可以促进纤维素酶活力，激发植物通气组织和不定根的形成。甘露等研究表明，水培芦荟表皮细胞比土生的要薄很多，木质化程度低，有通气组织和中空组织，皮层细胞有内陷[7]。陈永华等提出，植物的电导率、丙二醛含量和脯氨酸在水分胁迫下含量会上升，且随着胁迫时间延长而增加，但是水培花卉适应水中的环境，可启动与抗氧化相关的酶和抗氧化剂来降低由缺氧胁迫产生的氧自由基，避免细胞膜破坏，维持代谢正常[8]。也有少数国内外学者开始从分子角度研究水培能在水中长期生存的内在机理，如陈永华等[9]报道了在厌氧信号的传递下，激素信号、钙信号、乙烯信号、氧自由基等陆续被激活，在这些信号联级作用下相关基因的表达被启动，从而植物实现从陆生形式转变到水生形式。

红豆杉(Taxus)，是第四纪冰川遗留下来的古老树种[10]，在地球上已有250万年的历史，在自然条件下生长及其缓慢，再生能力差[11]，自1971年美国化学家Wall和Wani首次从短叶红豆杉树皮中分离得到具有抑制癌细胞有丝分裂，阻止癌细胞无限增殖功能的二萜烯类化合物紫杉醇(C47H51NO14)后被世人所知[12]。目前，已成功分离紫杉烷类物质、紫杉黄酮和红豆杉多糖等共500多种化学成分，具有显著防癌、抗肿瘤、抗氧化、清除自由基、调节心血管系统、抗衰老等药理学作用[13]。临床试验也表明，适当剂量的紫杉醇单独使用或与其他药剂结合使用，能有效治疗卵巢癌、乳腺癌、肺癌等多种晚期癌症[14]。但是紫杉醇在红豆杉植物中含量很低，原料紧缺，即使含量最高的短叶红豆杉树皮中也仅有0.01%～0.03%，且对树龄有严格要求，20年以上树龄才能获得微量的紫杉醇，所以紫杉醇的价格高出黄金几百倍[15]。在高额的利益趋势下，人工砍伐导致野生红豆杉自然日益匮乏，后期虽然受到重视并进行人工繁育栽培，但由于红豆杉种子休眠期长，枝条扦插繁殖条件苛刻，效果并不显著，所以导致红豆杉价格在花卉市场上居高不下。目前，急需一种有效的繁殖手段来改变红豆杉现有的危机局面。

若将水培技术运用到红豆杉的育种上，不仅可以带来巨大的经济价值，还能缓解红豆杉种质资源匮乏的现状，因此本试验运用水培技术，以水培红豆杉为研究对象，通过与土培红豆杉的比较，来揭示水培对红豆杉形态结构、生理生化等指标的影响，探索红豆杉从土培到水培的变化规律，为红豆杉水培工厂化生产提供理论基础与科学实践。

1 材料与方法

1.1 赤霉素(GA3)处理对水培红豆杉生根的影响

从宁波天胜花鸟市场购买30株大小相近的二年生中国红豆杉苗，剪取60枝长度相似的一年生枝条，放在1000倍75%甲基托布津可溶性粉剂中消毒15 min，分成6组，分别用0 mg/L、200 mg/L、400 mg/L、600 mg/L、800 mg/L和1000 mg/L的赤霉素GA3(上海源聚生物)处理60 s，取出阴干。阴干后将其放置在定植篮固定，在北仑沁香园农业科技有限公司的水培池上催根，控温在20～25℃，光照时间13 h/d，用遮阴网遮阴，采用间歇喷雾法保持空气湿润维持植株生存，湿润度控制在85%～90%，从试验开始，每5 d观察1次根生长情况，50 d测定各项指标，计算生根率平均值。

1.2 水培对红豆杉根系形态学的影响

比较红豆杉水生根与土生根的外观差异，剪取两者粗细相似的当年生根段，在FAA固定液(杭州化学试剂)中固定12 h。将固定好的组织依次用70%、80%、90%和100%乙醇(国药集团)脱水，然后二甲苯(无锡晶科化工)透明。透明后，将材料放入含有石蜡(上海华永)的玻璃皿中，65℃中浸蜡，取出晾置，按照切片制作方法制片，并放置42℃烘箱烤片1.5 h，后用二甲苯对切片进行脱蜡，脱蜡25 min，最后树胶封固观察[16]。

1.3 水培对红豆杉生理生化指标的影响

1.3.1 水培对红豆杉叶片色素含量的影响

取水培与土培红豆杉叶片0.1g，洗净擦干剪碎，加入少量石英砂(杭州化学试剂)和5 mL 80%丙酮(杭州高精细化工)研磨匀浆，再定容至25 mL，暗处静置10 min，测A663、A646和A470的吸光值，重复3次。

1.3.2 水培对红豆杉根组织酶活性的影响

从南京建成购买超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性、过氧化物酶(POD)活性，丙二醛(MDA)含量检测试剂盒，并按照试剂盒中的说明方法测定红豆杉水生根和普通根的SOD、CAT、POD的活性以及MDA含量，所有数据运用SPSS软件进行差异分析，P<0.05显著差异，P<0.01极显著差异。

2 结果与分析

2.1 赤霉素(GA3)对水培红豆杉生根的影响

将经过GA3处理的红豆杉苗按不同浓度分别放置在不同区域，统计不同浓度GA3对红豆杉水生根诱导率的影响。结果表明(表1)，水培技术可以用于红豆杉的繁殖，生根率高于传统扦插，且GA3对红豆杉生根有促进作用，但用400 mg/L的GA3处理，无论是愈伤、生根时间，还是平均根数及根长都明显优于其他浓度，说明添加GA3有利于根系的形成和伸长，但用量不能过量，否则会产生抑制生根的效果。

表1 不同GA3浓度对红豆杉根系生长量的影响

2.2 水培对红豆杉根系形态结构的影响

水培红豆杉初生根系洁白光滑，新生不定根较粗且直，二级根较短，几乎无根毛(图1-A、B、C)；而土培红豆杉根表皮呈红褐色，根系蜷曲且细长，基本上都盘在一起，根上分级多，多具二级、三级根系，并密生细根毛(图1-D、E、F)。显微结构比较发现，水培红豆杉表皮层很薄，皮层细胞紧凑，维管柱细胞数量较少，初生木质部细胞分化不明显，有通气组织产生(图1-H)；相比之下，土培红豆杉有明显的红褐色外表皮层，皮层细胞不紧凑，维管柱细胞数量多，有明显的初生木质部的分化，没有明显的通气组织形成(图1-G)。

2.3 水培对红豆杉生理生化指标的影响

2.3.1 水培对红豆杉光合色素指标的影响

土培红豆杉叶色暗绿，而水培红豆杉叶色较淡。由表2可知，水培红豆杉中叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素以及总叶绿素含量均低于土培红豆杉，分别是土培的65%、64%、70%及65%，但水培红豆杉a/b值是土培的1.03倍，说明水环境能引起红豆杉叶片光合色素含量的改变。

图1 水培与土培红豆杉根系结构比较

A、B、C—土培红豆杉根系结构；D、E、F—水培红豆杉根系结构；G—土培红豆杉显微结构；H—水培显微结构。a—维管柱细胞；b—通气组织。

表2 水培与土培红豆杉光合色素含量比较

图2 水培与土培红豆杉根组织酶活力比

Fig 2 The contrast of enzyme activity of between hydroponic and soil culturedTaxuschinensisroot tissue

“**”表示P<0.01。

2.3.2 水培对红豆杉根组织酶活性的影响

由图2可知，水培红豆杉超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)在活性上均高于土培组。土培红豆杉SOD活力为64.59 U/mg，水培的SOD为105.28 U/mg；土培CAT活力为572.58 U/g，水培为389.51 U/g；土培POD活力为104.52 U/mg，水培为167.23 U/mg；土培MDA含量为2.10 nmol/mg，水培为2.21 nmol/mg。运用SPSS软件分析表明，两者SOD 、CAT 、POD 均呈极限著差异，但两者丙二醛(MDA)含量相差不大，无显著差异，说明水培与土培红豆杉在部分生理生化指标上存在显著差异。

3 讨论

红豆杉生长缓慢，再分化的能力较弱，目前采用植物激素处理枝条来提高扦插生根率，但是由于土壤条件跟外界环境因子的制约，导致扦插成活率并不高，因此很难缓解红豆杉资源匮乏的现状，而水培技术正好弥补了这个缺陷，它彻底摆脱了耕地资源的制约，扩大了种植范围，同时在最大程度上降低了外界环境对繁殖率的影响，将整个生产过程实行人工智能调控，使温度、水分、光照和空气湿度始终处于最佳状态[17]，可实现周年生产。本实验通过赤霉素处理，利用人工智能大棚模拟红豆杉生根环境，成功获得了红豆杉水培苗，并确定促进红豆杉生根的最佳赤霉素浓度为400 mg/L。

水培红豆杉与土培红豆杉相比，有以下两点不同。

首先是整体形态上，水培红豆杉比土培红豆杉更饱满、水润。虽然两者叶片形态结构相似，但在根结构上差异显著，因土培红豆杉常与土壤中的土团颗粒、土壤紧密度相互作用，从而形成可抗土壤阻力的根系，此外，根系又易受到土壤含水量的影响，从而形成根毛区以扩大吸收面积增加水分、营养的吸收。而水培红豆杉根系直接浸泡在水中，水分充足，无需发达的根毛区，这与孔好等在吊兰[18]、甘露等在芦荟[7]水培研究中的结果一致。又由于水环境对根系的阻力较小，所以水生根系较脆、易折断。又因为水环境中存在低氧胁迫，为适应这样的环境，引发了红豆杉适应性生理过程[19]，形成了较发达的通气组织有助于根系供氧[20]。

在大面积人工培育红豆杉林的背景下，结合水培技术的优越性，建立红豆杉水培体系，从而实行工厂化生产具有一定的可行性，并且水培可提高红豆杉的某些理化指标。但红豆杉的主要价值是紫杉醇，而自然情况下紫杉醇含量很低。目前已成功利用诱导子实现紫杉醇含量增加的目的。如葛志强等[32]研究发现，在培养体系中加入适当Ce4+能够显著促进红豆杉细胞合成紫杉醇的能力。此外，梅兴国等实验也证实20 mg/L水杨酸对紫杉醇促进效果最明显，是对照的13倍[33]，但目前的研究都集中在细胞水平上，是否可通过水培体系促进红豆杉紫杉醇含量的合成，如在水培营养液中添加某些物质从而增加合成紫杉醇的能力，有待进一步研究与探索。

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The impact of hydroponic on root structure and physiological and biochemical index ofTaxuschinensis

LU Peng, GONG Yi-fu

(School of Marine Science, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

In order to alleviate the current situation ofTaxuschinensisgermplasm resource scarcity and improve the quality of artificial plantingTaxuschinensis, the gibberellic acid(GA3) to treat the biennial yewTaxuschinensiswas used to establish a inducing system of water root. Root structure, leaf pigment content and part enzyme activities, such as siperoxide dismutase(SOD), hydrogen peroxide(CAT), peroxidase(POD), malondialdehyde content(MDA), were measured in comparison of hydroponic and soil cultured yews to reveal the impact of hydroponic onTaxuschinensisroot structure physiologically and biochemically and explore the changing rules from soil culture to hydroponic ofTaxuschinensis. The optimal inducing concentration of GA3promoting yew rooting of water root was 400 mg/L. The hydroponic yew root structure was smoother and more white and compact than those in soil. Developed aerenchyma organization and lack of vascular cylinder cell and root hair and less lateral root were observed in hydroponic group. The contents of pigment in hydroponic group were lower than that in soil cultured group. The activity of SOD, CAT and POD in hydroponic group was higher than that in soil cultured group (P<0.01), although the MDA content showed no significant change. Our studies suggest that part of the morphological and physiological and biochemical indexes were changed to adapt to low oxygen environment during the hydroponic process, showing hydroponic can influence of root structure, pigment contents and some of the capacity of antioxidant, providing scientific theory basis for large fields of soilless cultivation ofTaxuschinensis.

hydroponic culture; taxus; microscopic structure; physiological indexes

2014-04-21；

2014-05-12

浙江省自然科学基金(LY13C020004)；宁波市科技攻关项目(LY13C020004)

龚一富，副教授，主要从事植物生化与分子的研究：E-mail：gongyifu@163.com。

Q945.15；Q946.5

A

2095-1736(2015)01-0067-05

作者简讯：卢 鹏，硕士研究生，主要从事植物生理方面研究，E-mail：904957079@qq.com；

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2015.01.067