白头翁总皂苷-羟丙基-β-环糊精包合物微丸生物利用度研究

管咏梅 刘红宁 杨 明 陈振华 陈丽华 张 妮

(江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室，南昌，330004)

白头翁总皂苷-羟丙基-β-环糊精包合物微丸生物利用度研究

管咏梅 刘红宁 杨 明 陈振华 陈丽华 张 妮

(江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室，南昌，330004)

目的：研究白头翁总皂苷-羟丙基-β-环糊精包合物微丸的生物利用度。方法：分别单剂量口服给药白头翁总皂苷和白头翁总皂苷-羟丙基-β-环糊精包合物微丸(200 mg/kg)，采用LC-MS法测定大鼠血药浓度，根据大鼠体内血药浓度经时过程,计算相应的药代动力学参数。结果：白头翁总皂苷和白头翁总皂苷-羟丙基-β-环糊精包合物微丸AUC分别为574.82和1776.32 μg/(L·h)。结论：白头翁总皂苷制成羟丙基-β-环糊精包合物微丸后生物利用度显著提高。

白头翁总皂苷；包合物；微丸；生物利用度

白头翁功擅清热解毒、凉血止痢，尤善清大肠湿热及血分热毒。现代药理研究结果证实，白头翁提取物具有良好的抗溃疡性结肠炎作用[1-2]，将其制成口服结肠靶向微丸有利于药物集中在病灶部位释放，改变传统白头翁汤剂灌肠给药的不便。

但白头翁总皂苷水中溶解度低[3]，直接制成微丸后药物难以释放，生物利用度低。课题组前期研究表明，将白头翁总皂苷制备成羟丙基-β-环糊精包合物结肠靶向微丸能够促进药物在结肠部位的释放[4]。我们通过LC-MS测定其体内血药浓度，以研究制成羟丙基-β-环糊精包合物微丸后的生物利用度变化情况。

1 材料与仪器

1.1 试药 常春藤皂苷元3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-[β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-L-吡喃阿拉伯糖苷对照品(中药固体制剂制造技术国家工程研究中心，批号：20111108)；白头翁总皂苷-羟丙基-β-环糊精包合物微丸(自制)；色谱乙腈(国药集团化学试剂有限公司)；蒸馏水(实验室自制)。

1.2 仪器 TG328A型分析天平(德国Sartoius公司)；3-18K型高速冷冻离心机(德国SIGMA公司)；XW-80A型旋涡混合器(上海青浦沪西仪器厂)；BF-2000型氮气吹干仪(八方世纪科技有限公司)；6410型三重四级杆液质联用仪(美国安捷伦科技有限公司)。

2 方法

2.1 血药浓度LC/MS测定方法的建立

2.1.1 色谱及质谱条件 色谱柱：Kinetex C18柱(100 mm×3.00 mm；2.6 μm；广州菲罗门有限公司)；柱温：30 ℃；流动相组成：见表1，其中A为乙腈，B为0.1%甲酸水溶液。流速：0.4 mL/mL；进样量：20 μL。

表1 LC/MS流动相组成

质谱检测条件：采用正离子电喷雾离子化(ESI)方式；选择性离子监测(SIM)：指标成分常春藤皂苷元3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-[β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-L-吡喃阿拉伯糖苷m/z：935.4[M+Na]+、内标人参皂苷Re m/z：969.4[M+Na]+；传输电压：135V；干燥气流速：10 L/mL；雾化压力：40psi；干燥气温度：350 ℃；Dwell：200。

2.1.2 对照品溶液和内标溶液的配制 1)指标成分对照品溶液的配制：取常春藤皂苷元3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-[β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-L-吡喃阿拉伯糖苷对照品约10 mg，精密称定，置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，制成对照品储备液。将该储备液稀释适当倍数，制成不同溶度的对照品溶液。2)内标物溶液的配制：取人参皂苷Re对照品约10 mg，精密称定，置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，再稀释适当倍数，制成内标物溶液。

2.1.3 血浆样品处理方法 取0.1 mL空白大鼠血浆3份，分别加入指标成分对照品溶液和内标物溶液各0.02 mL，涡旋振荡2 min，加乙腈0.3 mL，涡旋振荡5 min，12 000 r/min离心15 min，收集上清液，残渣加入0.3 mL乙腈同法再处理1次，合并上清液，于60 ℃水浴氮气吹干，残渣用200 μL甲醇振荡溶解，16 000 r/min离心20 min，取上清液得加药血浆样品。取空白大鼠血浆不加对照品溶液，同法处理，得空白血浆样品，分别进样分析，记录色谱图。

2.1.4 方法的专属性研究 在上述提取条件及色谱、质谱条件下，测定空白血浆、指标成分与内标物混合对照品、加药血浆及给药后血浆样品的LC-MS色谱图。

2.1.5 标准曲线的制备及最低检测限 取0.1 mL大鼠空白血浆，分别精密加入不同浓度的指标成分对照品溶液0.02 mL和1 000 ng/mL内标物溶液0.02 mL，按上述乙腈沉淀蛋白法处理样品，每种浓度3份样品，记录指标成分的提取离子流峰面积As与内标物的提取离子流峰面积Ais。以指标成分的提取离子流峰面积As与内标物的提取离子流峰面积Ais的比值R(As/Ais)对血样中指标成分对照品浓度C(ng·mL-1)作线性回归，考察线性范围并求得标准曲线方程。当信噪比(S/N)等于3时的血样浓度为最低检测限。

2.1.6 精密度 取0.1 mL大鼠空白血浆，分别精密加入高、中、低三种浓度的指标成分对照品溶液0.02 mL和1 000 ng/mL内标物溶液0.02 mL，按上述乙腈沉淀蛋白法处理样品。记录指标成分的提取离子流峰面积As与内标物的提取离子流峰面积Ais，将比值(As/Ais)代入标准曲线方程，计算测得浓度，考察日内和日间精密度。

2.1.7 回收率 取0.1 mL大鼠空白血浆，分别精密加入高、中、低三种浓度的指标成分对照品溶液和1 000 ng/mL内标物溶液各0.02 mL，按上述乙腈沉淀蛋白法处理样品，每种浓度平行做3份样品。记录指标成分的提取离子流峰面积As与内标物的提取离子流峰面积Ais。取与血样浓度相等的指标成分对照品溶液分别进样分析，记录提取离子流峰面积A。将比值(As/Ais)代入标准曲线方程，计算测得浓度，计算绝对回收率和方法回收率。

2.1.8 稳定性试验 取0.1 mL大鼠空白血浆，分别精密加入高、中、低3种浓度的指标成分对照品溶液，每种浓度平行3份。置于-20 ℃冰箱存放，分别于4 d和7 d后于37 ℃复融，按上述乙腈沉淀蛋白法处理样品并测定浓度。

2.2 白头翁总皂苷指标成分含量测定方法 SD大鼠随机分为两组，每组平行6只。实验前禁食不禁水24 h。按组别分别灌胃200 mg/kg白头翁总皂苷提取物和白头翁总皂苷-羟丙基-β-环糊精包合物微丸。分别于给药0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、10、12、24 h后采集血样，立即置于肝素化试管中，4 000 r/mim离心10 min。取0.1 mL血浆，加入1 000 ng/mL内标物溶液0.02 mL，涡旋振荡2 min，加乙腈0.3 mL，涡旋振荡5 min，12 000 r/min离心15 min，收集上清液，残渣加入0.3 mL乙腈同法再处理1次，合并上清液，于60 ℃水浴氮气吹干，残渣用200 μL甲醇振荡溶解，16 000 r/min离心20 min，取上清液进样分析，记录指标成分及内标物的提取离子流峰面积，计算其血药浓度。

2.3 数据处理方法 将各时间点血药浓度用DAS2.0药动学软件模拟，以AIC值为拟合度指标，在权重为1、1/C、1/C2条件下判断房室模型，并计算药动学参数。

3 结果

3.1 方法专属性 采用乙腈沉淀蛋白法，按照2.1.1中色谱及质谱条件，测得空白血浆、指标成分与内标物混合对照品、加药血浆及给药后血浆样品的LC-MS色谱图。

图1 LC/MS色谱图

由图1可见，指标成分常春藤皂苷元3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-[β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-L-吡喃阿拉伯糖苷保留时间约为6.8 min，内标人参皂苷Re保留时间约为1.5 min。血浆中内源性物质及其他成分均不干扰指标成分及内标的色谱峰。

3.2 标准曲线和最低检测限 大鼠空白血浆中精密加入不同浓度的指标成分对照品溶液0.02 mL，制成浓度分别为2.14，10.68，21.36，106.8，213.72，534.32，1068.6 ng/mL的含药血样，分别加入1 000 ng/mL内标物溶液0.02 mL，按上述乙腈沉淀蛋白法处理样品并进样分析，记录峰面积，以血浆中的指标成分和内标物的峰面积比值R(As/Ais)为横坐标，血样浓度C为纵坐标进行线性回归，得标准曲线方程见图2。当S/N为3时，用本法测得血浆中最低检测限为0.5 ng/mL。

图2 血浆HPLC-MS标准曲线

3.3 精密度研究结果 低、中、高三种不同浓度的含药血样于同一天不同时间测定5次，并每日测定1次，连续测定5 d，分别计算的日内精密度高中低浓度RSD分别为4.8%、7.2%、6.3%，日间精密度高中低浓度RSD分别为12.1%、9.4%、13.5%，表明样品日内日间精密度良好。

表2 精密度试验结果

3.4 回收率研究结果 低、中、高三种不同浓度的含药血样的绝对回收率和方法回收率见表3。实验结果表明，回收率可满足体内样品分析方法的要求。

表3 回收率试验结果

3.5 稳定性研究结果 低、中、高3种不同浓度的含药血样于-20 ℃冰箱分别存放4 d和7 d后测定浓度，结果表明指标成分在大鼠血浆中稳定性较好。

3.6 数据处理结果 实验测得白头翁总皂苷原药和包衣微丸的血药浓度和药时曲线分别见表5、表6和图3。

表4 稳定性试验结果

表5 白头翁总皂苷提取物口服给药后血药浓度(ng/mL)

表6 白头翁总皂苷微丸口服给药后血药浓度(ng/mL)

将血药浓度输入计算机，用DAS2.0药代动力学软件进行模拟，以AIC值作为拟合效果优劣的判断标准。结果表明，白头翁总皂苷原药和包衣微丸在大鼠体内的药动学过程均符合一室模型，权重为1/C2拟合比较合适。拟合的药动学参数分别见表7和表8。

结果可见，白头翁总皂苷羟丙基-β环糊精包合微丸口服给药后Tmax、Cmax、MRT与白头翁总皂苷相比均发生了显著改变，其中AUC分别为574.82和1776.32 μg/(L·h)，说明包合物包衣微丸口服给药后达峰时间和体内滞留时间延长，最大血药浓度降低，表现出一定的结肠靶向效应，而且将白头翁总皂苷制成羟丙基-β-环糊精包合物后再制成结肠靶向微丸，其大鼠体内生物利用度显著提高。

图3 口服给药后药时曲线

4 讨论

研究者在实验中分别采用乙腈沉淀蛋白法、甲醇沉淀蛋白法和乙酸乙酯萃取法处理大鼠血浆样品，结果发现乙腈沉淀蛋白法消除血浆中基质干扰的效果最好。

药物制成结肠靶向制剂后由于其在胃及小肠中释放量减少，生物利用度往往会下降[5]，而本文制备的结肠靶向微丸的生物利用度相比原药却有显著提高。其原因可能是本文中的结肠靶向微丸主要在回肠末端及结肠部位释药，根据本课题组对白头翁总皂苷提取物离体肠吸收行为的研究，其在小肠各部位与结肠部位的吸收无统计学意义，因此药物在回肠末端和结肠释放后均有一定程度的吸收。此外，本文中的微丸是以白头翁总皂苷-羟丙基-β-环糊精包合物为原料制备而成，包合物能够增加药物成分的溶出及吸收，从而提高其生物利用度。

[1]张文远，韩盛玺，杨红.白头翁醇提物对葡聚糖硫酸钠诱导大鼠结肠炎肥大细胞致炎作用的抑制研究[J].西部医学，2005，17(2)：99-101.

[2]张文远，韩盛玺，杨红.白头翁醇提物对葡聚糖硫酸钠诱导大鼠结肠炎的抗炎作用机制研究[J].中华消化杂志，2004，24(9)：568-570.

[3]陈振华，管咏梅，张妮，等.白头翁总皂苷溶解性能考察[J].中国实验方剂学杂志，2012，18(13)：28-30.

[4]陈振华，管咏梅，朱卫丰，等.白头翁总皂苷-羟丙基-β-环糊精包合物结肠靶向微丸生物利用度研究[J].中国中药杂志，2013，38(24)：4292-4297.

[5]程刚，肖云彩，吴寿荣，等.新型茶碱口服结肠靶向给药系统的体内动力学[J].沈阳药科大学学报，2003，20(1)：1-4.

表7 白头翁总皂苷提取物口服给药的药动学参数

表8 白头翁总皂苷包衣微丸口服给药的药动学参数

(2015-02-02收稿 责任编辑：洪志强)

Study on the Bioavailability of Pulsatilla Total Saponins-hydroxypropyl-β-cyclodextrin inclusion Clathrate Pellets

Guan Yongmei, Liu Hongning, Yang Ming，Chen Zhenhua, Chen Lihua, Zhang Ni

(KeyLaboratoryforModernPreparationofTraditionalChineseMedicineunderMinistryofEducation,JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330004,China)

Objective:To explore the bioavailability of Pulsatilla total saponins- hydroxypropyl -β- cyclodextrin clathrate pellets. Methods: The total Saponin of Pulsatilla Chinensis Regel and its OH-β-CD clathrate Pellets (200 mg/kg) were administered in rats respectively, the plasma levels were determined by LC-MS. Then the corresponding pharmacokinetic parameters based on the time process of blood drug concentration were calculated. Results: AUC of the Total Saponin of Pulsatilla Chinensis Regel and its OH-β-CD inclusion complex were 574.82 and 1776.32μg/L·h. Conclusion: The bioavailability of pulsatilla total saponins can be improved significantly by the technology of hydroxypropyl-β-cyclodextrin inclusion.

Pulsatilla total saponins; Inclusion; Pellet；Bioavailability

科技部十二五国家重大新药创制科技重大专项(编号：013ZX09103-002-001)；江西省自然科学基金项目(编号：20122BAB215041)；江西省教育厅科技落地计划项目(编号：赣财教[2011]243号)

管咏梅(1979—)，女，河南人，副教授，硕士研究生导师，研究方向：中药新剂型、新技术，联系电话：(0791)87118614，E-mail：guanym2008@163.com

杨明，男，教授，博士生导师，研究方向：中药新剂型、新技术、新辅料、新设备，联系电话：(0791)87118718，E-mail：yangming16@126.com

R944

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.03.008