干细胞移植治疗肝功能衰竭的研究进展及应用前景

吴贻琛 万志红 辛绍杰

干细胞移植治疗肝功能衰竭的研究进展及应用前景

吴贻琛 万志红 辛绍杰

肝脏是机体新陈代谢的中心，参与多种生理功能，肝功能衰竭是多种因素引起的严重肝脏损害，导致降解各种毒性物质、合成白蛋白等必需物质、分泌细胞因子、防御细菌病毒入侵等功能发生严重障碍或失代偿，病情常于短时间内迅猛进展，出现以凝血机制障碍、黄疸、肝性脑病、腹水等为主要表现的一组临床症候群［1］。其发生机制十分复杂，从肝细胞大量死亡角度看，肝组织在肝功能衰竭发生过程中依次经受了免疫损伤、缺血缺氧性损伤和内毒素血症的三重致死性打击，在疾病的不同时期，各自占有一定的主导地位［2］。因此，在疾病的不同时期，治疗方法也有所不同，但目前总体病死率高，治疗仍是世界性难题。

目前临床上治疗肝功能衰竭的有效手段，主要包括人工肝和原位肝脏移植［3］。人工肝治疗技术开展比较广泛，结合内科综合治疗，可以降低病死率，但存在潜在未知感染的风险，且该手段并非病因治疗，最终恢复还需依赖患者自身肝细胞的再生，故疗效尚不理想。原位肝移植是目前公认的治疗肝功能衰竭最为有效的方法，但因供体缺乏、手术损伤、免疫排斥、长期应用免疫抑制剂和高额的费用等缺陷，其临床应用严重受限，很多患者在漫长地等待移植供体过程中死亡。因此，及时有效的支持治疗和最大限度促进肝细胞再生将有助于肝功能衰竭患者自行恢复或者渡过等待移植时间的难关［4］。

近年来随着细胞生物学尤其是干细胞生物学的迅速发展，干细胞治疗在基础研究领域取得了重大进展。干细胞治疗是指将干细胞或由其分化产生的功能细胞直接或经体外遗传技术处理后，植入病变部位，使干细胞在组织中生长分化，以代替丧失功能的病变细胞，重构损伤组织，恢复器官功能［5-9］。有研究［10-11］证实干细胞在治疗肝脏疾病的实验中已取得不错的疗效。干细胞移植具有供体细胞来源丰富、手术损伤小、免疫排斥少、可重复使用、费用低等优点，有望成为替代疗法的新选择，为肝功能衰竭治疗开辟新的途径。

干细胞以多种形式存在于人体内，他们的共同特点是增殖能力极强并且可以分化为其他多种细胞。自细胞治疗技术开展以来，治疗细胞由最初的同种异体成熟肝细胞，发展为异种肝细胞、胎肝细胞、骨髓干细胞、脐血干细胞、外周血干细胞、胚胎干细胞、诱导型多能干细胞等。

一、胚胎干细胞

胚胎干细胞（em bryonic stem cell，ESC）：ESC属于全能干细胞，是干细胞家族分化潜能最高的一种细胞，可经诱导分化为外、中、内胚层的多种细胞，从而成为一个身体组织或器官的细胞，包括肝细胞。因此，理论上它们可用于肝再生。ESC目前的研究工作大多数集中于探索有效的方法来诱导其分化，使其成为有功能的肝细胞，并科学、客观地确定这种分化的完整性。Touboul等［12］应用激活素、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，F G F）-2、骨形态生成蛋白-4、磷酸肌醇-3激酶（phosphoinositide-3kinase，PI-3 K）抑制剂和F G F-10、维甲酸、激活素受体拮抗剂分两步诱导ESC分化，并成功获得了肝细胞。ESC分化的判断标准非常重要，确定是否成功诱导分化出有功能的肝细胞，不仅在于白蛋白的合成和分泌，也在于吲哚花青绿的吸收和释放、糖原储存、细胞色素P450氧化代谢功能等。目前，人类胚胎内胚层分化而来的ESC移植给急性肝损伤小鼠后，可在小鼠体内分化成肝细胞，完成肝细胞的功能［13］。但是，ESC作为肝干细胞移植的种子细胞还存在一些限制，例如，它的获得需要克服伦理的障碍，而且移植后又有致畸胎瘤的潜在风险。

二、骨髓干细胞

骨髓干细胞（bone marrow stem cell，B M SC）是目前干细胞研究的重点及热点，原因可能是不论体内还是体外实验，B M SC的获得都相对更加容易。B M SC主要有以下两种，即可生成各种血细胞的造血干细胞和位于骨髓间质的间充质细胞，它们都具有在一定条件下诱导分化为其他细胞的能力，因此理论上在特定的条件及环境诱导下，它们可以逐步分化为肝脏再生所需的细胞，帮助受损肝脏完成正常生理功能，达到治疗目的，且不涉及医学伦理。Petersen等［14］1999年首先报道，用2-A FF（2-acetvlamin of luorene）阻断大鼠肝细胞增殖，C Cl4造成肝细胞损伤后，进行性别交叉骨髓细胞移植或者全肝移植，在肝脏中发现来源于骨髓的肝细胞。Theise等［15］又报道了女性患者接受男性供体的骨髓移植后，受体的一些肝细胞和胆管上皮细胞核内含有Y染色体。两者均证明了骨髓干细胞能够在肝内转化为肝卵圆细胞甚至成熟的肝细胞和胆管细胞。Miyazaki等［16］通过切除90%的动物肝脏建立A L F模型，并体外诱导B M SCs向肝样细胞分化后治疗动物A L F，取得了良好的效果。

（一）造血干细胞 造血干细胞（H ematopoietic stem cells，H SC）是人类最早发现的一种，也是目前研究最多的一种，已广泛应用于细胞替代治疗、基因治疗及组织工程，体外分离、纯化技术也最成熟。H SC表面抗原标志主要有：C D34+、C D34-Lin-、C D133+、K D R+等，来源于多种组织，如骨髓、脐血、外周血和胎肝等，以骨髓中数量最多。有研究证实［17］，高度纯化的H SC不仅能补充多种造血系统成分，还可以在添加酪氨酸的肝损伤动物模型中分化为肝细胞，治疗肝功能衰竭。目前，国内外已开展多项骨髓来源H SC治疗肝功能衰竭的临床试验，结果显示，接受H SC治疗的患者体内可检测到肝细胞再生，并伴有血清T BIL下降、A L B升高及凝血功能改善［18-19］。另外，多个研究中心也开展了外周血H SC治疗肝病的研究。如Di Cam pli等［20］用G-CSF动员急性肝功能衰竭患者H SC，证实外周血C D34+细胞数量增加。国内的Yan等［21］采用外周血H SC治疗H B V相关的慢性肝功能衰竭，1周后患者的A L B明显升高，A L T、A ST和T BIL下降，随访1年，患者Child-Turcotte-Pugh评分明显改善。Gordon等［22］先予采用G-CSF动员，再由外周血中提取C D34+细胞，体外培养扩增后回输的治疗方法，患者症状缓解、肝功能改善，所有患者在治疗1年后仍存活，生化指标持续改善。李楠等［23］开展的外周血H SC治疗慢性肝功能衰竭也有相似的结果。

（二）间充质干细胞（mesenchy mal stem cell，M SC） 这是一种具有多向分化潜能的非造血干细胞，可分化为肝细胞、库普弗细胞、胆管细胞及肝窦内皮细胞等多种肝脏组成细胞。M SC最初是由骨髓中分离得到，为造血干细胞的发育分化提供必需的微环境，之后又在皮肤、胰腺、脐带及脂肪等多种组织中分离得到，来源丰富。研究发现M SC具有多种细胞表面抗原，但无特异性，一般认为表达C D13、C D29、C D44、C D54、C D73、C D90、C D105、C D166、Stro-1等，不表达C D11b、C D14、C D31、C D34、C D45、C D79a、H L A-D R等［24］。M SC可以在体外大量扩增和长期培养，不仅可作为肝干细胞移植的种子细胞，而且易于接受外源基因的导入，用作基因治疗的靶细胞。目前已发表的B M-M SCs移植试验中，大部分应用单纯B M-M SCs移植的方法，总体疗效良好，有较高的安全性。B M-M SCs除了部分分化为相应组织细胞如肝细胞外，同时可合成多种生长因子，对肝脏内局部微环境产生营养性旁分泌作用，包括抗炎、刺激内源性细胞增殖和血管增生等。Suganu ma等［25，26］应用B M-M SCs移植治疗肝功能衰竭大鼠，发现 B M-M SCs能够分泌多种生长因子和细胞因子，促进肝脏血管再生及肝细胞增殖，抑制免疫细胞向肝脏迁移，调节肝功能衰竭大鼠肝脏及全身炎症反应，提高了大鼠的生存率。研究还表明［27］，B M-M SCs分泌的因子能够逆转急性组织损伤，可能与其上调IL-10水平有关。另有研究发现，损伤的肝组织可以通过分泌细胞因子的方式促进干细胞向肝细胞的分化［28］。随着B M-M SC再生研究的深入，发现其具有迁徙至损伤或者炎症病变部位的能力，并可参与组织再生，但确切作用机制还没有得到完全清楚的阐述。近年来，有关此方面的研究已经逐步开展临床实验。Pietrosi［29］等分析了全世界27例肝功能衰竭患者 B M-M SCs移植术后的临床资料，结果显示，大部分患者病情有不同程度的好转。Peng等［30］进行的自体B M-M SC移植的临床研究，选取53例终末期乙肝患者为治疗组，选择同期105例终末期乙肝患者作为对照组，经过随访观察，证实治疗组肝功、M eld评分等指标改善均明显优于对照组，未发现严重不良反应及并发症。以上一系列研究表明，自体 B M-M SCs移植安全有效，对于肝脏疾病的恢复具有较好的治疗作用。

然而，并不是所有的研究都很乐观，近期一些机构的研究就曾证实［31-34］，由骨髓干细胞分化而来的肝细胞样细胞没有像所预期的那样，拥有理想的自我复制能力。更有研究指出［35］，一定概率下骨髓干细胞可以分化为可生成胶质纤维的肝星状细胞和成纤维细胞，使肝脏内生成了无法逆转的瘢痕样组织，当其移植到患者体内后，有可能促进肝纤维化的发展。

三、脐血干细胞

脐血干细胞（u m bilical cord blood stem cell，U C BSC）：脐血中含有无限制成体干细胞、间充质干细胞、造血干细胞等多种干细胞成分。脐血中干细胞比例明显高于成人骨髓及外周血。与B M SC相比，U C BSC更为原始，免疫原性较弱，不表达主要组织相 容 性复 合 基 因 （M H C）Ⅱ 类 分 子和 死 亡 因 子 配体（FasL），不表达 M H CⅠ类分子，也不表达白细胞分化因子7-1 （B7-1）、B7-2、C D40、C D40L等分子，可以逃避免疫监视，来源广泛，数量多，分化能力强，易于采集和保存，脐血受胎盘屏障的保护，被病毒、细菌污染的概率低，并且没有伦理学的限制。目前，U C BSC分化为肝细胞的可行性及其移植的疗效也已经得 以 证 实［36，37］。

四、诱导多能干细胞

诱导多能 干细胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）：2006年，Takahashi［38］从24种与细胞多能性相关的基因中筛选出了4个转录基因（Oct4、Sox2、Klf4和c-M yc，O S K M），利用逆转录病毒载体将这些因子转染到小鼠的成体细胞（小鼠胚胎成纤维细胞和成体尾巴成纤维细胞），使这些细胞重新编程，利用另一个多能性标记分子Fbx15的表达对转染后的细胞进行筛选，得到了类似小鼠胚胎干细胞特性的多潜能干细胞，这就是诱导多能干细胞。2007 年，Takahashi［39］利用 O S K M 四种基因转录因子将人皮肤的成纤维细胞重新编程为iPSC。自此不同种属、不同组织来源、不同年龄、不同疾病患者的细胞均可诱导产生iPSC。iPSC像胚胎干细胞一样具有多向分化潜能，在体内可以分化为3个胚层来源的所有细胞，进而参与形成机体某种组织和器官，如肝脏［40］。理论上iPSC也可能发育为胚胎，重新孕育生命。Sullivan等［41］证实iPSC可分化为肝脏内胚层细胞，且有效分化率为70%～90% ，iPSC源性肝细胞可表达肝细胞核因子（hepatocyte nuclear factor，H N F）-4α，并合成Alb、A FP、细胞色素（cytochro me P450，C Y P）-7 A1等肝脏功能性蛋白。iPSC的建立为获得多潜能性干细胞提供了一个相对简易可靠的新方法，而且个体特异来源的iPSC不会引起免疫排斥反应，更为重要的是iPSC细胞的建立不需要卵细胞，也不需要破坏胚胎发育，避免了伦理上的限制，但仍存在重编程效率低、编程基因致癌风险高、细胞增殖分化不可控等问题。

五、肝干细胞移植的理论基础

目前关于归巢的干细胞在终末期肝病治疗中的作用机理尚无定论，主要有3种假说：①细胞转分化学说，认为归巢的干细胞在体内分化为功能性肝细胞，替代肝脏原有功能。②细胞融合学说，认为归巢的干细胞与原有肝细胞融合成为含两套或多套染色体的细胞，再经减数分裂形成“中间细胞”，从而发挥作用。③旁分泌学说［42］，目前被大多数学者所接受，该学说认为归巢的干细胞通过分泌各种细胞因子，如IL-6、T N F-α和H G F等，一方面作用于已损伤的肝细胞，改善其功能状态；另一方面，抑制局部免疫反应、增加血管再生，促进干细胞归巢并减少其凋亡，延缓纤维化进展。目前还需要大量相关研究以明确干细胞的作用机理。

六、问题及展望

肝干细胞移植已经初步应用于临床，但是作为一种新兴的疗法，目前仍存在一些技术问题：（一）干细胞本身生理特性的研究还需要进一步加深，阐明干细胞移植治疗的作用机制及干细胞诱导分化机制，对后续研究非常重要；（二）对干细胞体外分离、培养、鉴定等技术需要进一步简化；（三）培养、分化过程中需要预防干细胞向肿瘤细胞分化；（四）移植细胞数量和疗效之间的关系目前未阐明，动物实验中移植数量多为 106～107个，而据推算，移植于人体的干细胞数量约需109个，确切的移植数量还需要大量研究来确定；（五）肝功能衰竭患者体内的免疫状态、内毒素、高胆红素使自身肝细胞呈大块或亚大块坏死而难以生存，干细胞的生存及功能状态如何维持？（六）移植时机、移植途径及细胞发挥功能所需时间也是值得研究的问题；（七）目前临床上仍只能通过移植后功能检测来评价干细胞移植后的疗效，无法真正显示干细胞的分布，因此需要寻求无创、简便、有效的示踪手段加以监测；（八）干细胞与体内组织细胞的相互作用机制以及影响仍有待进一步研究；（九）干细胞移植治疗肝功能衰竭的疗效还需要得到设计严格的临床试验的验证。

尽管存在上述一些问题，但干细胞移植仍为肝功能衰竭患者提供了一条新的治疗途径。其具体作用机制仍亟待深入研究和探讨，且干细胞真正应用于临床治疗肝衰竭还有漫长的道路要走，但相信不久的将来，干细胞移植技术必将发挥更加重要的作用。

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三相并网逆变器的MPDPC策略如图3所示,不同的电压矢量产生不同的有功和无功功率变化,因此,存在多种方式去选择合适的开关状态去控制有功和无功功率。采样三相电网电压和电流,分别在8个矢量的作用下计算出下一周期的功率预测值,将预测值代入式(9),根据误差最小化原则,选取最优矢量。p*由直流电压外环PI调节器的输出与直流电压的乘积给定,q*通常设为0,以实现单位功率因数运行。

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2014-12-02）

（本文编辑：魏清）

国家“十二五”重大专项（2012Z X10002004-005）；全军医学科技青年培育项目（13 Q N P192）

100853 北京，解放军医学院（吴贻琛、辛绍杰）；解放军第三○二医院肝硬化诊疗中心（吴贻琛）；解放军第三○二医院肝衰竭诊疗与研究中心（万志红、辛绍杰）

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