马陆内生真菌Xylariaceae sp．次级代谢产物的研究

郑燕丽， 邹 坤， 程 凡

(三峡大学 天然产物研究与利用湖北省重点实验室， 湖北 宜昌 443002)



马陆内生真菌Xylariaceaesp．次级代谢产物的研究

郑燕丽， 邹 坤， 程 凡*

(三峡大学 天然产物研究与利用湖北省重点实验室， 湖北 宜昌 443002)

研究了马陆肠道内生真菌Xylariaceaesp.的次级代谢产物.通过溶剂提取法和多种色谱方法分离单体化合物，并利用现代波谱技术和理化性质进行结构鉴定.分离并鉴定了13个化合物，分别为吩嗪-1-羧酸(1)，肉桂酸(2)， 2-n-庚基-4-羟基喹啉(3)，N-苯甲基氨基甲酸(4)，酪醇(5)， 2，3-二羟基-1-(3-吲哚基)丙酮(6)， 3，4-二羟基苯甲酸(7)，胸腺嘧啶(8)，环(甘氨酸-苯丙氨酸)(9)，环(4-羟基-脯氨酸-亮氨酸)(10)，环(4-羟基-脯氨酸-苯丙氨酸)(11)，环(甘氨酸-脯氨酸)(12)，环(甘氨酸-亮氨酸)(13).所有化合物均为首次从该属菌种中分离得到.

马陆； 内生真菌； 次级代谢产物；Xylariaceaesp．

马陆(Spirobolus Bungii)也称千足虫，是迄今发现的最古老陆地生物.属节肢动物门(Arthropoda)多足纲(Myriapoda)倍足亚纲(Diplopoda)动物[1].身体有多节，长筒形，有发达坚厚的外骨骼[2].马陆又称马炫，《本草纲目》中记载“马炫处处有之，形如蚯蚓，紫黑色，其足比比至百，而皮极硬，节节有横文如金线，首尾一般大，触之即侧卧局缩如环”、“其主治破积聚，疗寒热痞结，恶疮等”[3].

野生炭角菌大多生于腐木或木材上，是一种分布较广的内生真菌[4]，某些炭角菌有很高的药用价值[5-6].研究表明，内生真菌可能产生与其宿主相同或相似的生理活性物质[7-8].所以从马陆肠道中分离得到的一株内生炭角菌Xylariaceaesp.可能会有较高的药用价值，有必要对其发酵产物进行化学成分研究，本实验从炭角菌Xylariaceaesp.发酵产物中共分离和鉴定了13个化合物，所有化合物均为首次从该属菌种中分离得到.化合物1～13的化学结构如图1所示.

图1 化合物 1 ～ 13 的结构式Fig.1 Structures of compounds 1 ～ 13

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Bruker AV 400核磁共振波谱仪，瑞士布鲁克公司；AmozonSL+1200液相色谱-双重漏斗传输离子阱质谱仪，德国布鲁克·道尔顿公司；CBM-10A分析型高效液相色谱系统，LC-6AD二元梯度泵，SPD-20AV紫外检测器，日本岛津公司；低温冷冻干燥机，美国Labconco公司；WZZ-2S数字式自动旋光仪，上海精科公司；旋转蒸发仪，日本EYELA；ME215S型1/10万电子天平，德国Sartorius公司；Cosmosil MS-II RP-C18色谱柱(5 μm，250×10 mm半制备型；5 μm，250×4.6 mm分析型)；薄层色谱硅胶GF254，青岛海洋化工有限公司；正相色谱硅胶，烟台化学工业研究所；除了分析和制备用的色谱纯乙腈和色谱纯甲醇外，其它试剂均为分析纯.

1.2 菌株的分离、纯化及鉴定

供试菌株分离自马陆肠道，昆虫样品于2013年5月采集于湖北宜昌.分离前让马陆饥饿24 h，于无菌条件下解剖，将马陆置于75%酒精中表面消毒5 min，然后3%次氯酸钠中消毒3 min，再用无菌水漂洗3次后，取出马陆肠道加少量无菌水在无菌研钵中研磨，用无菌水对研磨液梯度稀释成10-1、10-2、10-3、10-4，分别取各梯度稀释液0.2 mL涂布于PDA培养基中，置于28℃恒温箱中培养，待样品周围长出菌丝，挑取单一菌落(菌体、气生菌丝或孢子)在PDA平板上平行划线，划线完毕后将平板倒置于28℃恒温箱中培养.长出菌丝后继续反复多次的划线培养，同时镜检观察，至平板上新长出的菌落的外部形态一致[9].

菌株由三峡大学涂璇副教授根据真菌形态特点和18S r DNA鉴定为炭角菌Xylariaceaesp.，现保存在三峡大学生物与制药学院天然产物研究与利用湖北省重点实验室.

1.3 培养基

培养基：PDA培养基(土豆200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1 000 mL，pH值自然)；SD培养基(葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，水1 000 mL，pH值自然)，1.25×105Pa灭菌20 min.

1.4 发酵

菌株经PDA培养基斜面活化后，接种于SD种子培养基中，于28℃、125 r/min振荡培养2 d；将培养好的种子液以5%的接种量接种于SD发酵培养基中，于摇床上28℃、125 r/min振荡培养10 d，共发酵25 L.

2 提取与分离

发酵液25 L过滤、离心，再经乙酸乙脂萃取，减压浓缩得13.6 g粗提物.将上述粗提物合并，经正相硅胶柱色谱(800 g正相硅胶，200～300目)分离，氯仿-甲醇(100∶0～50∶50%，V/V)梯度洗脱，得53个馏分.经TLC及HPLC分析，合并相同组分得6个片段(Ⅰ～Ⅵ).Fr.Ⅰ部分经甲醇重结晶，得到化合物1(27.6 mg)；Fr. Ⅱ部分经RP-HPLC制备，以乙腈-水(68∶32，V/V)恒梯度洗脱，得化合物2(7.8 mg，Rt=7.8 min)、化合物3(17.2 mg，Rt=12.1 min)、化合物4(12.2 mg，Rt=6.5 min)、化合物12(20.3 mg，Rt=25 min)；Fr.Ⅲ部分经RP-HPLC制备，以乙腈-水(24∶76，V/V)恒梯度洗脱，得化合物6(8.1 mg，Rt=4.7 min)、化合物7(5.8 mg，Rt=17.6 min)；Fr.Ⅳ部分经RP-HPLC制备，以乙腈-水(15∶85，V/V)恒梯度洗脱，得化合物8(3.6 mg，Rt=6.4 min)、化合物9(7.1 mg，Rt=16.3 min)、化合物10(11.5 mg，Rt=27.5 min)、化合物11(3.9 mg，Rt=39 min)；Fr.Ⅴ部分经RP-HPLC制备，以乙腈-水(10∶90，V/V)恒梯度洗脱，得化合物13(2.1 mg，Rt=18.7 min)、化合物5(1.9 mg，Rt=27.7 min).

3 结构鉴定

化合物1.黄色针状晶体(甲醇)，m.p. 238～239℃，ESI-MSm/z:225 [M+H]+；1H NMR(400 MHz， CDCl3)δH:15.55(1H， br s， COOH-1)，8.98(1H， dd，J=1.2 Hz， 7.2 Hz， H-4)，8.53(1H， dd，J=1.2 Hz， 4.8 Hz， H-2)，8.33(3H， m， H-3， H-7， H-8)，8.01(2H， m， H-6， H-9)；13C NMR(100 MHz， CDCl3)δC:166.2(COOH-1)，144.2(C-10a)，143.6(C-9a)，140.3(C-5a)，140.0(C-4a)，137.6(C-3)，135.3(C-4)，133.4(C-9)，132.0(C-6)，130.5(C-2)，130.2(C-8)，128.1(C-7)，125.1(C-1).以上数据与文献[10]报道一致，故鉴定化合物1为吩嗪-1-羧酸.

化合物2.无色针状晶体(氯仿)，m.p. 131～133℃，ESI-MSm/z:149 [M+H]+；1H NMR(400 MHz， CDCl3)δH:7.80(1H， d，J=16.0 Hz， H-7)，7.56(2H， dd，J=2.4 Hz， 6.0 Hz， H-2， H-6)，7.42(3H， m， H-3， H-4， H-5)，6.47(1H， d，J=16.0 Hz， H-8)；13C NMR(100 MHz， CDCl3)δC:172.4(C-9)，147.3(C-7)，134.3(C-1)，131.0(C-4)，129.2(C-3， C-5)，128.6(C-2， C-6)，117.6(C-8).以上数据与文献[11]报道一致，故鉴定化合物2为肉桂酸.

化合物3.白色粉末，m.p. 364～408℃，ESI-MSm/z:244 [M+H]+；1H NMR(400 MHz， CDCl3)δH:12.32(1H， br s， OH-4)，8.35(1H， t，J=7.6 Hz， H-5)，7.58(1H， t，J=6.8 Hz， H-6， H-8)，7.32(1H， t，J=7.6 Hz， H-7)，6.24(1H， br s， H-3)，2.68(2H， br s， H-1′)，1.69(4H， d，J=6.4 Hz， H-2′， H-6′)，1.23(6H， m， H-3′， H-4′， H-5′)，0.80(3H， t，J=7.2 Hz， H-7′)；13C NMR(100 MHz， CDCl3)δC:179.1(C-4)，155.5(C-2)，140.9(C-8a)，132.0(C-5)，125.5(C-6)，125.2(C-4a)，123.8(C-7)，118.8(C-8)，108.3(C-3)，34.6(C-1′)，31.8(C-5′)，29.4(C-2′)，29.3(C-3′)，29.2(C-4′)，22.8(C-6′)，14.2(C-7′).以上数据与文献[12]报道一致，故鉴定化合物3为2-n-庚基-4-羟基喹啉.

化合物4.黄色固体，m.p. 101～103℃，ESI-MSm/z:152 [M+H]+；1H NMR(400 MHz， CDCl3)δH:10.94(1H， br s， OH-8)，9.03(1H， br s， NH-7)，7.35(5H， m， H-2， H-3， H-4， H-5， H-6)，3.71(2H， s， H-7)；13C NMR(100 MHz， CDCl3)δC:177.6(C-8)，133.7(C-1)，129.6(C-2， C-6)，128.8(C-3， C-5)，127.5(C-4)，41.3(C-7).以上数据与文献[13]报道一致，故鉴定化合物4为N-苯甲基氨基甲酸.

化合物5.无色油状物，m.p. 90～92℃，ESI-MSm/z:139 [M+H]+；1H NMR(400 MHz， DMSO-d6)δH:9.13(1H， br s， OH-4)，6.98(2H， dd，J=2.0 Hz， 6.8 Hz， H-2， H-6)，6.65(2H， dd，J=2.0 Hz， 6.4 Hz， H-3， H-5)，4.57(1H， br s， OH-2′)，3.51(2H， t，J=6.8 Hz， H-2′)，2.59(2H， t，J=7.2 Hz， H-1′)；13C NMR(100 MHz， DMSO-d6)δC:155.5(C-4)，129.7(C-2， C-6)，129.4(C-1)，114.9(C-3， C-5)，62.6(C-2′)，38.3(C-1′).以上数据与文献[14]报道一致，故鉴定化合物5为酪醇.

化合物6.无色结晶(甲醇)，m.p. 200～202℃，ESI-MSm/z:206 [M+H]+；1H NMR(400 MHz， DMSO-d6)δH：：11.97(1H， s， NH-1)，8.42(1H， s， H-2)，8.21(1H， dd，J=1.6 Hz， 6.0 Hz， H-4)，7.48(1H， dd，J=1.2 Hz， 6.4 Hz， H-7)，7.20(2H， m， H-5， H-6)，5.11(1H， d，J=6.0 Hz， OH-10)，4.72(1H， s， OH-9)，4.68(1H， dd，J=5.2 Hz， 10.4 Hz， H-9)，3.69(1H， dd，J=6.0 Hz， 10.8 Hz， H-10a)，3.63(1H， dd，J=5.2 Hz， 10.4 Hz， H-10b)；13C NMR(100 MHz， DMSO-d6)δC:195.4(C-8)，136.2(C-7a)，134.7(C-2)，125.8(C-3a)，122.8(C-6)，121.7(C-5)，121.3(C-4)，113.9(C-3)，112.0(C-7)，75.7(C-9)，65.2(C-10).以上数据与文献[15]报道一致，故鉴定化合物6为2，3-二羟基-1-(3-吲哚基)丙酮.

化合物7.白色粉末，m.p. 196～198℃，ESI-MSm/z:155 [M+H]+；1H NMR(400 MHz， DMSO-d6)δH:7.56(1H， s， H-2)，7.50(1H， dd，J=1.8 Hz， 8.2 Hz， H-6)，6.92(1H， d，J=8.2 Hz， H-5)；13C NMR(100 MHz， DMSO-d6)δC:166.9(COOH-1)，149.7(C-4)，144.6(C-3)，122.7(C-6)，122.2(C-1)，116.5(C-2)，114.7(C-5).以上数据与文献[16]报道一致，故鉴定化合物7为3，4-二羟基苯甲酸.

化合物8.白色片状结晶(甲醇)，m.p. 315～317℃，ESI-MSm/z:127 [M+H]+；1H NMR(400 MHz， DMSO-d6)δH:10.99(1H， br s， HN-3)，10.62(1H， br s， HN-1)，7.25(1H， s， H-6)，1.72(3H， s， CH3-5)；13C NMR(100 MHz， DMSO-d6)δC:165.0(C-4)，151.5(C-2)，137.7(C-6)，107.6(C-5)，11.8(CH3-5).以上数据与文献[17]报道一致，故鉴定化合物 8 为胸腺嘧啶.

4 结论

本研究采用常规的色谱分离纯化方法，对马陆肠道内生真菌炭角菌Xylariaceaesp.的次级代谢产物进行了系统分离.从其乙酸乙酯萃取物中分离并鉴定了13个化合物，包括吩嗪-1-羧酸(1)，肉桂酸(2)，2-n-庚基-4-羟基喹啉(3)，N-苯甲基氨基甲酸(4)，酪醇(5)，2，3-二羟基-1-(3-吲哚基)丙酮(6)，3，4-二羟基苯甲酸(7)，胸腺嘧啶(8)，环(甘氨酸-苯丙氨酸)(9)，环(4-羟基-脯氨酸-亮氨酸)(10)，环(4-羟基-脯氨酸-苯丙氨酸)(11)，环(甘氨酸-脯氨酸)(12)，环(甘氨酸-亮氨酸)(13).以上研究结果进一步阐明了马陆肠道内生真菌炭角菌Xylariaceaesp.次级代谢产物的化学成分特点，为其化学成分及相关生物活性的研究奠定了基础.

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Secondary metabolites fromXylariaceaesp. of Spirobolus Bungii endophytic fungus

ZHENG Yanli， ZOU Kun， CHENG Fan

(Hubei Key Laboratory of Natural Products Research and Development，China Three Gorges University, Yichang， Hubei 443002)

To study secondary metabolites fromXylariaceaesp. of Spirobolus Bungii endophytic fungus, the compounds were isolated by different solvent extraction and chromatographic methods. Their structures were identified by modern spectral technology and physicochemical properties. Thirteen compounds were obtained and identified as phenazine-1-carboxylic acid (1)， cinnamic acid (2)， 2-n-heptyl-4-hydroxyquinoline (3)， N-(phenylmethy)-carbanic acid (4)， tyrosol (5)， 1-(3-indolyl)-2，3-dihydroxypropan-1-one (6)， 3，4-dihydroxy benzoic acid (7)， thymine (8)， cyclo (Gly-Phe) (9)， cyclo (4-hydroxyl-Pro-Leu) (10)， cyclo (4-hydroxyl-Pro-Phe) (11)， cyclo (Gly-Pro) (12) and cyclo (Gly-Leu) (13). All the compounds were isolated from the endophytic fungus ofXylariaceaesp. for the first time．

Spirobolus Bungii; endophytic fungus; secondary metabolites;Xylariaceaesp．

2015-02-26.

湖北省自然科学基金项目(2014CFB692)；三峡大学人才科研启动基金项目(KJ2014B026).

1000-1190(2015)03-0392-05

O629

A

*通讯联系人. E-mail: fancy1351@163.com