假单胞菌HS-D36偏苯三酚1， 2-双加氧酶克隆表达与催化特性研究

李景龙， 袁永泽， 李丹丹， 杨雪婷， 耿 辉， 熊 丽， 刘德立

(华中师范大学 生命科学学院， 武汉 430079)



假单胞菌HS-D36偏苯三酚1， 2-双加氧酶克隆表达与催化特性研究

李景龙， 袁永泽， 李丹丹， 杨雪婷， 耿 辉， 熊 丽， 刘德立*

(华中师范大学 生命科学学院， 武汉 430079)

由pnpC编码的偏苯三酚1，2-双加氧酶(Hydroxyquinol 1，2-dioxygenase，PnpC)是微生物分解硝基芳香族类环境污染物的关键酶.本研究从对硝基苯酚(p-nitrophenol，PNP)降解菌HS-D38(Pseudomonassp.)中克隆pnpC基因，利用E.coliBL21(DE3)高效表达重组PnpC，通过亲和色谱纯化并分析其催化特性.实验结果表明：HS-D36的pnpC开放阅读框长度为873 bp，编码290个氨基酸，酶蛋白相对分子量33 KD；20℃、异丙基硫代-β-半乳糖苷(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)诱导可高效表达重组PnpC；重组酶经Ni-NTA亲和色谱一步分离可达到电泳纯；纯酶比活力9.3 U/mg，纯化倍数37.2，活力收率23.8%；重组PnpC催化邻苯二酚开环反应的最适温度45℃、最适pH 5.0；Lineweaver-Burk双倒数作图表明PnpC对邻苯二酚降解的米氏常数(Km)为21.95 mol/L、最大反应速度(Vmax)为2.68 mol/(min·mg)；Fe3+、Cu2+、Fe2+和Zn2+对该酶具激活作用，Ni2+则显示抑制效应.

对硝基苯酚； 偏苯三酚1， 2-双加氧酶； 表达纯化； 催化特性

对硝基苯酚(p-nitrophenol；PNP)广泛用于化学合成农药、医药和染料.化工生产释放以及有机磷农药(如甲基对硫磷)降解产生的PNP是环境污染的重要来源，严重危害公共健康[1].PNP是国际环保组织规定的优先监测的污染物之一，水体残留上限为10 ng/L[2].PNP水溶性较强，易扩散且残留期长，是环境修复的重要对象，在水环境修复领域尤为受关注[3].与传统的化学降解比较，利用微生物代谢或关键酶降解PNP具有高效绿色、无二次污染等优点，是目前PNP环境修复研究中的热点[4-5].

自然界存在多种具有PNP降解特性的微生物，包括Pseudomonassp.、Bacillussp.、Rhodococcussp.、Arthrobactersp.、Burkholdriasp、Moraxellasp.和Flavobacteriumsp.[6-8].PNP微生物降解主要通过苯二酚和苯三酚途径：革兰氏阴性菌以苯二酚途径为主， 革兰氏阳性菌多采用苯三酚途径，但也有例外[8-10].细菌偏苯三酚1， 2-双加氧酶(PnpC)是苯三酚途径关键酶之一，它负责催化PNP脱硝基产物偏苯三酚的开环反应，这是芳香烃裂解为三羧酸循环前体进入彻底氧化途径的限速步骤[11-12].最近，细菌PNP降解操纵子克隆研究揭示革兰氏阴性菌也有pnpC同源基因[13-14].其酶学功能还需要进一步研究.

本研究从PNP高效降解菌HS-D36(实验室分离鉴定为铜绿假单胞菌[15])基因组中克隆了pnpC全长序列，表达并分离纯化了重组PnpC蛋白，研究了其酶学特性.以此为基础可以深入探讨微生物降解PNP的生物化学机制.

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒与主要试剂

铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa) HS-D36为本实验室分离保藏.E.coliDH5α与BL21(DE3)由本实验室保存.pMD18-T、pET28、限制性内切酶NdeI、XhoI以及T4DNA连接酶购自Takara公司.氨苄青霉素、硫酸卡那霉素(Kana)、IPTG与DNA回收试剂盒为Takara公司产品.Ni-NTA亲和色谱填料与色谱柱购自GE Healthcare公司.邻苯二酚标准品为Sigma Aldrich产品.其它常规生化试剂均为分析纯.

1.2 pnpC基因克隆与pET-pnpC的构建

根据GenBank公布的pnpC基因序列设计引物.正、反向引物分别为5’-CGGCATATGACC-GATCATTACAAAG-3’和5’-TCGCTCGAG-TTATTCCGCCTCCATG-3’(划线处依次为NdeI和XhoI酶切位点).以HS-D36基因组为模板，PCR扩增pnpC基因.PCR程序设定：94℃预变性2 min；94℃变性50 s，50℃退火50 s，72℃延伸1 min，循环30次；72℃延伸10 min.纯化PCR产物，插入到pMD18-T构建重组质粒 pMD-pnpC，并转化E.coliDH5α， 酶切鉴定阳性克隆并测序.NdeI和XhoI双酶切pMD-pnpC，并亚克隆到pET28构建重组表达质粒pET-pnpC，转化E.coliBL21并筛选阳性克隆.

1.3 重组PnpC的诱导表达

过夜活化E.coliBL21/ pET-pnpC，转接到新鲜LB培养基(含50 μg/mL Kana).恒温摇床37℃、150 r/min培养2～3 h，检测菌液OD600.在对数期(OD600=0.6)加入1 mmol/L IPTG诱导目的蛋白，培养物于37℃继续生长8 h或于20℃生长24 h.间隔取样，10，000 g、10 min离心，收集菌体.SDS样品缓冲液处理，沸水浴10 min，裂解菌体细胞，短时冰浴后离心(5，000 g、2 min)取上清液.SDS-PAGE分析重组PnpC表达.

1.4 亲和色谱纯化重组PnpC

诱导培养物于20℃生长24 h后10，000 g、10 min离心集菌， 50 mmol/L PBS(pH 7.5)洗涤两次.50 mmol/L PBS重悬，置冰浴中，间歇超声破碎(0.5s/0.5s) 15 min.4℃、15000 g离心30 min，收集上清，即PnpC粗酶液，取5 mL用于亲和色谱纯化.Ni-NTA亲和柱体积1 mL，以10 mL缓冲液(20 mmol/L PBS、300 mmol/L NaCl、10 mmol/L咪唑、pH 8.0)平衡色谱柱，粗酶上样量5 mL，充分结合后以10 mL缓冲液(20 mmol/L PBS、300 mmol/L NaCl、60 mmol/L咪唑、pH 8.0)漂洗，最后用缓冲液(20 mmol/L PBS、300 mmol/L NaCl、150 mmol/L咪唑、pH 8.0)洗脱目的蛋白.根据Bradford法测定蛋白浓度[16].

1.5 重组PnpC活性测定

PnpC活性测定参照文献[17].以邻苯二酚标准品为底物，检测单位时间内产物顺， 顺-己二烯二酸的生成量(A260增加率).定义30℃、1分钟催化产生1 μmol顺， 顺-己二烯二酸所需的酶量为1个酶活力单位.

1.6 重组PnpC催化特性分析

设定温度梯度15、30、45、60和75℃，测定不同温度下的PnpC活性.调节酶测活缓冲液pH为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0，在上述梯度pH下分别测定PnpC活性.酶反应系统中添加硫酸镍、硫酸铜、氯化锌、氯化锰、氯化亚铁、氯化铁或氯化钴，控制Ni2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Fe2+、Fe3+或Co2+终浓度为200 μM，检测PnpC活性.设定邻苯二酚在酶反应体系中终浓度为1.0、1.3、1.7、2.5和5.0 μM，检测反应初速度，Lineweaver-Burk作图分析Km和Vmax.

2 结果与分析

2.1 pnpC基因的克隆与表达

以HS-D36基因组为模板，PCR扩增pnpC基因，在约870 bp处出现特异条带(图1A).PCR产物插入pMD18-T，转化E.coliDH5α.提取质粒，单酶切鉴定正确，双酶切释放约870 bp的目的条带(图1B、C).挑选阳性克隆，送公司测序.序列分析表明pnpC开放阅读框873 bp，蛋白质一级结构290个氨基酸残基，理论分子量约为33 KD.

(A)PCR 产物; (B)pMD-pnpC用内切酶XhoI酶切检测; (C)pMD-pnpC用.NdeI 和XhoI限制性内切酶双酶切检测

pET-pnpC转化E.coliBL21(DE3)， IPTG诱导，SDS-PAGE分析证明重组蛋白表达成功，特异条带出现在约35 KD位置，符合HS-D36中PnpC-His6的理论分子量(图2A).37℃诱导表达的PnpC主要为包涵体，上清中含量较低(图2A).低温诱导可抑制包涵体形成，提高可溶性表达.如图2B所示，20℃诱导表达的PnpC主要分布于上清液.

2.2 亲和色谱分离纯化重组PnpC

酶上清液经Ni-NTA亲和色谱分离纯化获得了电泳纯PnpC(图3).分离纯化后，酶比活力达到每毫克蛋白9.3个活力单位，纯化倍数约为37倍，活性回收率接近24%(表1).

(A)E.coli BL21/pET-pnpC在37℃下诱导.M，标准蛋白标记；1，不诱导；2～3，诱导3～8 h；4～5，上清和沉淀；(B)E.coli BL21/pET-pnpC在20℃下诱导.M，标准蛋白标记；1～2，上层清液和沉淀.

M：标准蛋白质标记；1：粗酶液；2:60 mmol/L的咪唑洗脱液；3:150 mmol/L的咪唑洗脱液

表1 Ni-NTA亲和色谱纯化重组PnpC

2.3 重组PnpC的催化性质

PnpC催化邻苯二酚或偏苯三酚的邻位开环.偏苯三酚极易被氧化，水溶液中氧化产物干扰酶活性测定.本研究选用稳定性较强的邻苯二酚为底物研究重组PnpC的催化特性.该酶催化邻苯二酚生成顺， 顺-己二烯二酸的最适温度和最适pH分别为45℃和5.0(图4).

图4 温度(A)和pH(B)对PnpC活性的影响Fig.4 Effect of temperature (A) and pH (B) on the activity of recombinant PnpC

如表2所示，Fe(Ⅲ)、Fe(Ⅱ)、Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)和Co(Ⅱ)促进酶活力，其中Fe(Ⅲ)、Fe(Ⅱ)和Cu(Ⅱ)是PnpC较强的激活剂.Ni(Ⅱ)则抑制酶活力.

表2 金属离子对PnpC活力的影响

*对照：将没有添加任何金属离子的酶的活力定义为 100%．

酶动力学实验在45℃、pH5.0条件下进行.Lineweaver-Burk作图显示PnpC对邻苯二酚的Km和Vmax分别为22.0 μM和2.7 μmol/(min·mg)(图5).

图5 重组PnpC的Lineweaver-Burk作图Fig.5 Lineweaver-Burk analysis of recombinant PnpC

3 讨论

偏苯三酚1， 2-双加氧酶是革兰氏阳性菌苯三酚途径降解PNP的关键酶，近年有证据表明pnpC功能基因也存在于革兰氏阴性菌[18-19].目前已完成的革兰氏阴性菌pnpC克隆包括假单胞菌属4例和伯克氏菌属1例[12-13，19-21].本研究克隆了革兰氏阴性菌HS-D36(铜绿假单胞菌)pnpC(图1).该基因与Pseudomonassp. WBC-3pnpC(GenBank注册号EF577044)高度同源[5].两者开放阅读框虽然只有3个核苷酸差异，却导致了酶蛋白氨基酸序列上的3个点突变(Q4H， E5Y和R33Q).运用亲和色谱纯化，Pseudomonassp. WBC-3重组PnpC的活力收率仅为10%[11].本研究证明低温(20℃)能显著提高假单胞菌PnpC的可溶性表达(图2)；同时，亲和色谱纯化的酶活力回收率升高到24%(表1).说明提高重组PnpC活性表达水平对于优化酶制备技术具有重要的意义.

已有研究证明PnpC有2种催化机制，以Fe(Ⅲ)为辅酶的外二醇型(intradiol)双加氧酶和以Fe(Ⅱ)为辅酶的内二醇型(intradiol)双加氧酶[22-23].本研究中，Fe(Ⅲ)激活HS-D36 PnpC (表2)，表明该酶具有外二醇型双加氧酶特征.有趣的是，Fe(Ⅱ)也是该酶的激活剂，不仅如此，Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)、Co(Ⅱ)等二价金属离子均可促进该酶活性，尽管程度有差异.说明该酶也可采用内二醇型催化机制.铜绿假单胞菌PnpC特殊的辅酶依赖性可能与一级结构上的氨基酸突变有关，其详细机制还有待验证.

我们已报道了HS-D36降解PNP包含非典型苯二酚途径[24].本研究在克隆表达与分离纯化HS-D36 PnpC基础上提出革兰氏阴性菌PnpC存在多种金属辅酶依赖关系(表2).为深入探讨非典型苯二酚途径的酶学机制提供了参考.已有研究证明，革兰氏阴性菌DLL-E4(臭假单胞菌)和WBC-3(施氏假单胞菌)降解PNP中都涉及部分苯三酚途径以及PnpA、PnpG等关键酶基因[11，18].说明包括PnpC在内的苯三酚双加氧酶对于细菌PNP分解代谢具有重要意义，其酶学特性和作用机制还有待深入揭示.

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Expression， purification， and characterization of the recombinant hydroxyquinol-1， 2-dioxygenase fromPseudomonassp. strain．

LI Jinglong， YUAN Yongze， LI Dandan， YANG Xueting， GENG Hui， XIONG Li， LIU Deli

(School of Life Science， Central China Normal University， Wuhan 430079)

Hydroxyquinol 1， 2-dioxygenase (PnpC)， encoded bypnpCgene， is a key enzyme for bacteria to degrade a series of recalcitrant nitrophenol pollutants， such as p-nitrophenol (PNP). In the present work， apnpCgene from Pseudomonas sp. strain HS-D36 was cloned which was able to degrade PNP efficiently. The open reading frame of thepnpCcontains 873 nucleotides and codes for 290 amino acids (PnpC) with the molecular weight of 33 KD. The recombinant PnpC was highly expressed in E.coli BL21(DE3) as a histidine-tag fusion protein and purified to homogeneity by one step of Ni-NTA affinity chromatography. The specific activity of the purified protein reached at 9.3 U/mg. The optimum temperature and pH of the PnpC for catechol were 45℃ and pH 5.0， respectively. Lineweaver-Burk plot of the PnpC activity against catechol indicated thatKmwas 21.95 mol/L andVmaxwas 2.68 mol/(min·mg). In addition， the enzyme activity was activated by Fe3+， Fe2+， Cu2+， Zn2+， Mn2+， and Co2+， while inhibited by Ni2+．

p-nitrophenol; hydroxyquinol 1， 2-dioxygenase; expression and purification; catalytic property

2015-07-23.

国家自然科学基金项目(31371893,31071653,31101595).

1000-1190(2015)05-0758-05

Q814.1

A

*通讯联系人. E-mail:deliliu2013@163.com.