小鼠脊髓损伤后对少突胶质细胞前体细胞发育的影响

沈嘉希，刘阿娟，杨俊林

（杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江 杭州310036）

脊髓损伤之后损伤区域周围活跃的星形胶质细胞将会形成胶质疤痕［1］，很大程度上阻碍了脊髓损伤后神经元的修复［2］，此外，损伤以后微环境将发生剧烈的变化，且各类免疫细胞会释放多种因子.本研究旨在探索这些微环境的变化对少突胶质细胞前体细胞（Oligodendrocyte progenitor cells，OPCs）发育的影响.PDGFRa是血小板源性生长因子受体家族的一员，在中枢神经系统中，PDGFRa只表达在未分化的OPCs中［3］.体内试验表明，PDGFRa敲除的小鼠中OPCs的增殖受到明显抑制而分化提前［4］.因此，PDGFRa被认为是比较好的OPCs的标记分子.

脊髓损伤目前还没有非常有效的治疗方案，现有主要的治疗方案包括干细胞移植［5］或诱导性多功能干细胞（induced pluripotent stem cells，IPSC）移植［6］、重编程损伤区域中的星形胶质细胞［7］等.移植后的OPCs主要分化形成星形胶质细胞，因此通过观察损伤区域微环境的变化对OPCs发育的影响，对移植OPCs／OLs（Oligodendrocyte cells，少突胶质细胞）治疗脊髓损伤具有参考价值.本研究利用PDGFRa-creER小鼠和Rosa-tdTomato小鼠品系在特定时间内来示踪损伤后OPCs细胞的去向：在脊髓损伤前5d予以腹腔注射药物Tomaxifen［8］，诱导tdTomato 的表达，标记损伤前的PDGFRa阳性细胞在脊髓损伤后的转变.

1 材料和方法

1.1 小鼠及主要试剂

PDGFRa-creER＋／-小鼠购买自Jackson lab.Rosa-tdTomato＋／＋小鼠由杭州师范大学发育与再生研究所刘阳老师实验室提供.PBS、庆大霉素购自美国Gicbco公司.山羊血清和蔗糖购自美国Invitrgen公司.包埋剂购自美国Thermo公司.0.1%Triton、氢氧化钠和Tris-HCl购自上海生工.戊巴比妥钠、多聚甲醛（PFA）和戊二醛购自美国Sigma公司.抗体为anticc1（Abcam，AB16794），antiPDGFRa（Abcam，AB61219），antiGFAP（Millipore，AB5804）.

1.2 Tomaxifen诱导小鼠

得到PDGFRa-creER／Rosa-tdTomato小鼠后的第25天时，对小鼠注射40mg／mL 的Tomaxifen溶液（溶剂为95%的植物油和5%的无水乙醇）0.1mL，连续注射5d.

1.3 损伤小鼠脊髓

在小鼠腹腔注射戊巴比妥钠，待小鼠麻醉后，将脊髓T7～T10之间的表皮去毛，剪开背部皮肤，在手术显微镜下取出小鼠T8或T9区域脊髓背侧的骨头，在脊髓损伤仪下进行损伤.损伤后用手术线将伤口缝合，并在损伤处留下一小段手术线作为标记.最后在腹腔注射庆大霉素，降低术后感染.

1.4 处理小鼠脊髓

先将小鼠麻醉，剪开小鼠腹腔到胸腔处，露出心脏，将PBS用泵注入右心室，并把左心房剪个小口子，当肝脏颜色退去后，改注射4%的PFA.待小鼠全身肌肉僵硬后，取出损伤段脊髓置于冰上，在PBS中将脊髓取出，放入4%的PFA 中在4 ℃冰箱过夜固定.第二天用30%的蔗糖溶液替换PFA 溶液对脊髓进行脱水.在包埋材料前，将包埋剂在冰上预冷，锡箔纸折成正方形后放在干冰上并将包埋剂加入锡箔纸内，然后迅速把脊髓垂直底面放入包埋剂内，等包埋剂凝固后放入-80 ℃冰箱保存.包埋好的材料在冰冻切片机上切片（厚度为14μm），贴完材料的玻片放入片盒在-80 ℃冰箱保存.

1.5 免疫荧光

将脊髓组织切片放入PBS洗5min，重复3次.5%的山羊血清室温封闭30min，按稀释比例加入一抗，放入水盒在4 ℃过夜.第二天取出片子后继续用PBS洗5min，重复3次，加入荧光标记的二抗，室温孵育1h.最后用PBS洗3遍，每次5min，封片，在荧光显微镜和激光共聚焦显微镜下照相.

1.6 电镜

剖开小鼠胸腔后，用含有戊二醛的PB进行灌注，取出损伤区域，放在PB 中保存.在浙江大学农业与生物技术学院电镜公共平台进行后期处理，在锇酸中脱水，然后依次在由低到高不同浓度梯度的乙醇中脱水.包埋剂包埋后定位损伤部位，之后对材料超薄切片，电子显微镜下照相.

2 结 果

2.1 小鼠Tomaxifen作用下的诱导效率

为了探究PDGFRa阳性细胞在小鼠脊髓损伤后的变化，选用基因型为PDFGRa-creER／Rosa-tdTomato的小鼠作为研究对象，在两个不同的时期通过腹腔注射Tomaxifen诱导Cre的表达起到示踪的作用.选取小鼠出生后第15天（P15）和第30天（P30）两个时期作为参照.PDGFRa阳性细胞随着小鼠的发育逐渐减少（图1），PDGFRa和tomato的信号符合本研究要求（P＜0.05）.

图1 Tomaxifen诱导下tdTomato可以正常表达Fig.1 The expression of the tomato under the action of Tomaxifen

2.2 小鼠脊髓损伤后损伤区域的修复

本研究选择在小鼠P30时期做损伤实验，因为这个时期小鼠脊髓中PDGFRa阳性细胞处于比较稳定的状态，并且细胞的分裂活性较高.用50Kdynes损伤小鼠脊髓T8或T9段后，小鼠会在一段时间后恢复部分行动能力，在该条件下能观察小鼠脊髓的自我修复.本研究在P30时期损伤后，继续饲养小鼠一个月后取材，电镜观察（图2）可见：在物理损伤情况下，大部分的髓鞘都已消失，很多神经元在损伤下死亡.以喂酮腙实验作为比较，28d连续喂饲小鼠酮腙后，取胼胝体在电镜下观察，药物并不能非常干净地脱髓鞘，会有少许的残留，而物理损伤的情况则比较严重.

脊髓损伤后会形成许多的胶质疤痕，对野生型的P30小鼠脊髓伤后30d取材，通过免疫荧光染GFAP抗体后确定损伤区域（图3）.胶质疤痕主要由星形胶质细胞、成纤维细胞和小胶质细胞等组成，会阻碍神经元轴突的再生和髓鞘的修复［1］.

图2 物理损伤和酮腙作用下脱髓鞘的情况Fig.2 The effect of physical injury and ketone hydrazone demyelinating

图3 物理损伤后形成的胶质疤痕Fig.3 The glial scar under the physical injury

图4 大部分tdTomato阳性细胞表达CC1Fig.4 The tomato positive cells express CC1

2.3 PDGFRa阳性细胞在损伤后的表达

PDGFRa主要表达在OPCs以及更早期的胶质祖细胞等，本研究对PDFGRa-creER／Rosa-tdTomato小鼠在P25时期腹腔注射Tomaxifen，在P30时期进行脊髓损伤，并在损伤后休养30d恢复部分活动能力后取材.通过免疫荧光染少突胶质细胞标志蛋白CC1后发现，大多数tdTomato阳性的细胞表达CC1（图4）.说明在损伤以后，大部分的PDGFRa阳性细胞分化成为少突胶质细胞，参与形成髓鞘.

此外，极少数tdTomato阳性的细胞不表达CC1（图5）.笔者认为这些细胞可能是新形成的星形胶质细胞，因此做了针对GFAP免疫荧光.在激光共聚焦显微镜下发现有极少数tdTomato阳性细胞的确表达GFAP（图6），表明在脊髓损伤后，有极少部分PDGFRa阳性的细胞参与形成了星形胶质细胞.

图5 CC1-／tdTomato＋的细胞Fig.5 The CC1negative and the tdTomato positive cells

图6 GFAP＋／tdTomato＋的细胞Fig.6 The GFAP positive and tdTomato positive cells

3 讨论

本研究发现，在损伤后的一个月，PDGFRa阳性的OPCs及其子代细胞主要分化成为CC1阳性的少突胶质细胞，这表明，PDGFRa阳性的细胞在损伤后主要参与髓鞘的修复，但是仍然有少部分PDGFRa阳性的细胞在损伤后参与分化成为GFAP阳性的星形胶质细胞.小鼠脊髓损伤后体内微环境发生了极大的改变，在各类免疫细胞释放的因子作用下，影响了少数OPCs的正常成熟途径.在体外实验中，OPCs可以分化成为星形胶质细胞［9］，但是在体内实验中，还未探索是否存在这条途径.

以往的研究［10］表明，使用软磷脂对小鼠脱髓鞘后，部分PDGFRa阳性细胞形成施旺细胞并分化成髓鞘，也有一些PDGFRa阳性的细胞表达GFAP信号.物理损伤或使用软磷脂脱髓鞘后，体内微环境发生改变，使少部分OPCs细胞的命运发生了改变.因此通过比较正常脊髓微环境和损伤后微环境的差别，可以寻找出影响OPCs发育的因素，这为今后提高干细胞移植或OPCs在治疗脊髓损伤时分化成为OLs的效率、抑制移植的细胞分化成为星形胶质细胞提供了应用基础.

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