核因子E2相关因子2信号通路及其在紫外线致皮肤蛋白氧化应激损伤中的作用

江娜 朱慧兰

核因子E2相关因子2信号通路及其在紫外线致皮肤蛋白氧化应激损伤中的作用

江娜 朱慧兰

紫外线照射产生活性氧及自由基，与皮肤光老化、皮肤癌等皮肤光损伤疾病的发生相关。活性氧及自由基不仅通过攻击氨基酸主侧链等方式氧化蛋白质，而且能够激活丝裂原活化蛋白激酶产生基质金属蛋白酶，降解皮肤结缔组织中的胶原蛋白等蛋白质，使皮肤发生光损伤。核因子E2相关因子2信号通路是细胞氧化应激反应的核心调控机构，在应激条件下，激活核因子E2相关因子2，通过调节抗氧化酶类和Ⅱ相解毒酶基因的表达，清除过多的核因子E2相关因子2和自由基，抑制基质金属蛋白酶的分泌，保护蛋白质，增强机体抗氧化应激的能力，对皮肤起到保护作用。核因子E2相关因子2信号通路及其调控机制与皮肤蛋白氧化应激损伤间关系的深入研究，将有利于寻找蛋白氧化应激损伤导致的相关皮肤光损伤疾病新的有效的治疗防御措施。

紫外线；氧化性应激；信号传导；Nrf2

1 核因子（NF）E2相关因子2（Nrf2）信号通路及其调控机制

Nrf2能与NF-E2珠蛋白基因启动子结合，是调节抗氧化应激反应的重要转录因子。Kelch样ECH相关蛋白1（Keap1）是一种胞质抑制蛋白，在细胞质内与Nrf2结合，抑制Nrf2进入细胞核。亮氨酸拉链转录因子家族有 6 个成员 NF-F2、Nrf1、Nrf2、Nrf3、Bach1和Bach2。Nrf2几乎在所有组织中表达，Nrf2敲除小鼠的Ⅱ相解毒酶和内源性抗氧化水平下降。近年来，一直认为，Nrf2只有6个功能域Neh1-6区，研究发现，Nrf2的第7个功能域Neh7，位于Neh5和Neh6区之间，包含209～316个氨基酸，是与视黄醇类受体相互作用的区域，该功能域是一潜在的药物靶点，在肿瘤及代谢性疾病的防治中可能起作用［1］。

正常情况下，Nrf2与Keapl结合形成Nrf2-Keap1复合物，并在细胞质中降解。Keapl的IVR结构域中富含半胱氨酸残基，在亲电子物和氧化应激等情况下，构象发生改变，从而导致Nrf2与Keapl解离［2］，Nrf2被激活并与Keap1解离，由胞质转移至细胞核内，Neh1结构域中的bZip与sMafs蛋白形成异二聚体，识别并结合到Ⅱ相基因启动区的抗氧化反应元件(ARE）上，启动其调控的Ⅱ相解毒酶，加速和调控抗氧化酶基因转录和表达［3-5］。ARE作为特异性DNA启动子结合序列，主要存在于编码Ⅱ相解毒酶和抗氧化蛋白基因的启动子区域。ARE调控的Ⅱ相解毒酶能增强细胞对氧化应激和亲电子化学物质的耐受性，提高细胞抗氧化应激的能力，维持体内氧化还原平衡［6］。因此，Nrf2-Keap1-ARE 信号通路是抗氧化应答机制中最重要的信号通路。

蛋白激酶C（PKC）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）等多种激酶途径可能参与Nrf2的磷酸化过程。蛋白激酶C介导的Nrf2磷酸化可能是Nrf2核易位的关键因素，Nrf2磷酸化后，使得蛋白激酶对Nrf2 的降解作用减弱［7］。

生理状态下，Bachl对Nrf2通路起抑制作用，Bach1与sMafs蛋白形成的异二聚体与ARE结合，但不具有转录活性。当细胞受到氧化应激等刺激因素作用时，Bachl可与ARE解离，释放出细胞核并降解，Nrf2从Keapl复合体中释放后，进入细胞核与ARE结合，诱导Nrf2调控的下游基因表达［8］。

Nrf2的非Keap1依赖降解途径与Neh6区相关，GSK-3能磷酸化Neh6区中的6个氨基酸，介导Nrf2非Keap1依赖泛素化降解作用，Rada等［9］提出了 Nrf2 的“双重降解”机制。Chowdhry 等［10］研究发现，Neh6上的两个模序 DSGIS338和 DSAPGS378与β-TrCP相互作用，其中，β-TrCP仅作用于磷酸化的DSGIS，说明GSK-3β磷酸化的位点是DSGIS而非DSAPGS，激活糖原合成酶激酶-3能够提高对DSGIS的磷酸化。因此，降解肿瘤细胞中的Nrf2是通过非Keap1依赖的降解途径。Keap1直接作用于p62，p62通过与Nrf2竞争性结合Keap1，抑制了Keap1介导的Nrf2泛素化和蛋白酶体降解，使得核内Nrf2积累并激活其下游基因，说明p62是细胞内源的Nrf2诱导剂，对调控Nrf2依赖的蛋白质合成、自噬相关的蛋白质降解、维持细胞内蛋白质合成与降解的稳态起着重要的作用［11］。

DeNicola等［12］首次报道，在 Nrf2 或 Keap1 未发生突变的情况下，K-Ras、B-Raf和Myc等原癌基因也可通过Mek-Erk-Jun信号通路激活Nrf2转录，增强Nrf2蛋白质稳定性，从而激活Nrf2的抗氧化程序，清除活性氧（ROS），使细胞内环境还原性增加。原癌基因能持续上调Nrf2基因转录是抗氧化程序激活的一个新机制。

2 蛋白氧化应激损伤及其机制

蛋白氧化是指蛋白质由ROS直接诱导或经与氧化应激生成的副产物反应而间接诱导发生的共价改变。正常生理情况下，ROS在生物体内的生成与清除处于动态平衡状态，当各种因素使得这一平衡被打破，导致ROS浓度超过生理限度从而损伤生物大分子，蛋白质是ROS作用的主要目标。ROS主要氧化蛋白质的主链和侧链。赖氨酸和精氨酸等脂肪族氨基酸的侧链通过大量烷氧自由基和过氧自由基反应形成蛋白质的羰基衍生物，蛋白质的羰基及其衍生物已作为由ROS介导的重要的蛋白质氧化标志物。芳香族与杂环氨基酸的芳香环或杂环是自由基主要攻击的位点，经ROS的作用后，这些芳香环或杂环被氧化甚至断裂。半胱氨酸和蛋氨酸对ROS极其敏感，但由于生物体系中含有二硫化物还原酶和蛋氨酸还原酶，被氧化损伤的半胱氨酸和蛋氨酸得以修复。

ROS对蛋白质的主要作用包括修饰氨基酸残基，导致蛋白质结构和构象及免疫原性改变，造成肽键断裂，形成蛋白质的交联聚合物等。ROS所致蛋白质肽链断裂方式有两种：肽链水解和从碳原子处直接断裂。ROS攻击碳原子上的氢是肽链直接断裂的方式，而肽键水解常发生在脯氨酸。酪氨酸形成的二酪氨酸，半胱氨酸氧化形成的二硫键均可形成蛋白质的交联。脂质过氧化产生的丙二醛与蛋白质氨基酸残基反应生成的烯胺，也可以形成蛋白质交联。蛋白质经氧化后热力学结构变得不稳定，部分三级结构打开，失去原有构象［13］。

3 紫外线致皮肤蛋白氧化应激损伤的机制

紫外线可以干扰细胞信号转导过程，产生过量的ROS，一旦ROS生成的量超过机体抗氧化系统的清除能力时，氧化应激便会发生，这与皮肤晒伤、色素沉着，光老化和皮肤癌密切相关。紫外线按波长分为短波紫外线（UVC，100～290 nm），中波紫外线（UVB，290～320 nm），长波紫外线（UVA，320～400 nm）。波长较短的UVC几乎全部被臭氧层吸收，不能到达地面。大部分UVB被表皮吸收，少量透过真皮可达基底层，引起细胞的功能改变；而UVA大部分能透过真皮，少量透过真皮深达皮下组织，产生氧自由基，从而导致成纤维细胞损伤，同时使皮肤的免疫功能受损。

紫外线照射后局部皮肤中开始出现白细胞浸润，这些白细胞能产生大量的ROS。经紫外线反复照射后，皮肤细胞中的线粒体受损，导致电子传递和氧化磷酸化功能缺陷，皮肤细胞中开始出现过量的ROS。皮肤结缔组织中，胶原蛋白的氨基酸组成恰巧含有大量的甘氨酸、赖氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸，这些氨基酸属于脂肪族氨基酸和杂环氨基酸，脂肪族氨基酸的侧链和杂环氨基酸的杂环正是ROS和自由基攻击位点。ROS作为第二信使，参与紫外线照射后的细胞内信号传导过程，增强膜表面磷酸化，激活MAPK产生基质金属蛋白酶（MMP）。MMP能够特异性的降解皮肤结缔组织中蛋白质，如胶原酶（MMP-1）能将纤维状胶原劈裂，降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原；明胶酶（MMP-2）可降Ⅳ型胶原、变性胶原和弹性蛋白；蛋白多糖酶（MMP-3）能降解Ⅴ、Ⅹ型胶原、蛋白多糖、纤连蛋白及变性胶原等。过多的MMP使得皮肤组织中的胶原蛋白与弹性蛋白降解，胶原合成减少，促进胶原蛋白交联聚合，最终导致皮肤真皮层中的胶原蛋白和弹性蛋白减少，弹性纤维降解，皮肤失去弹性，出现皱纹，皮肤干燥松弛，发生皮肤光老化。研究显示，成纤维细胞虽位于真皮层却更易发生氧化损伤［14］，而成纤维细胞正是合成胶原和弹性纤维的主要场所。过量的ROS还可以损伤线粒体DNA，引起DNA突变，激活原癌基因，导致皮肤肿瘤的发生。

4 Nrf2信号通路在紫外线致皮肤蛋白氧化应激损伤中的作用

在生理条件下，Nrf2在细胞质中与Keap1结合而被抑制，而当紫外线照射发生氧化应激或产生过量ROS时，半胱氨酸在Keap1中的残留量会增加，导致Keap1活性变弱，Nrf2和Keap1解离，Nrf2进入细胞核，与sMafs蛋白形成异源二聚体，并和ARE连接在一起。ARE激活后启动转录抗氧化基因，调控抗氧化酶、Ⅱ相解毒酶。Nrf2与ARE相互作用调节编码的下游抗氧化酶以及Ⅱ相解毒酶主要有细胞内氧化还原平衡蛋白类和Ⅱ相解毒酶类，前者的主要功能是保持细胞内谷胱甘肽和硫氧还蛋白水平，减少ROS的产生，如γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽过氧化物酶、硫氧还蛋白、硫氧还蛋白还原酶、过氧化物酶基因、血红蛋白加氧酶-1。后者的功能是将外源物质转化为毒性较小的形式，以及催化共轭反应引起外源物质的溶解，使其更易排出，包括谷胱甘肽S转移酶、NAD（P）H醌氧化还原酶-1、UPD-葡糖醛酸基转移酶［15］。

抗氧化酶类作为 Nrf2信号通路的主要调节蛋白，是维持机体氧化还原平衡的重要因素，通过催化自由基转化为无毒物质和增加其水溶性从而利于自由基排除来发挥作用［16］。血红蛋白加氧酶-1是血红蛋白降解的限速酶，生理条件下，Bach1结合ARE抑制血红蛋白加氧酶-1的转录，当氧化应激发生时，Nrf2从胞质转移至核内并能与ARE区相结合，启动血红蛋白加氧酶-1的表达［17］，而血红蛋白加氧酶-1则能抑制MMP的生成，清除ROS产生的自由基，从而避免蛋白质遭到自由基的氧化。

Nrf2激活剂通过激活Nrf2依赖的基因表达，在应激条件下对皮肤起到保护作用。表没食子儿茶素没食子酸酯为绿茶提取物，作为目前研究最多的Nrf2激活剂之一，对皮肤的抗氧化作用主要表现在减少紫外线诱导的自由基生产，减少炎症和刺激，可以促进表皮的分化。表没食子儿茶素没食子酸酯能减轻紫外线导致的红斑，能抑制UVB诱导的皮肤中白细胞浸润及随后产生的ROS［18］。同时，表没食子儿茶素没食子酸酯可以明显抑制蛋白多糖酶的产生［19］，减少胶原蛋白的降解，使皮肤厚度和表皮水分损失明显减轻［20］，对防治皮肤光老化可能有一定作用。Nrf2激活剂姜黄素可激活Nrf2-Keap1系统并能诱导谷胱甘肽等表达量增加［21］。姜黄素能明显抑制由UVB诱导产生的胶原酶和蛋白多糖酶［22］，但该实验并未表明使用姜黄素可以保护皮肤组织中的胶原蛋白、弹性蛋白等蛋白质避免受到紫外线照射的损伤，这也提供了一个新的研究方向。白藜芦醇可以抑制MMP的生成［23］，保护胶原蛋白避免受到紫外线照射后降解。原花青素清除氧自由基的能力也较强，对蛋白质氧化损伤有保护作用，但在皮肤上的应用尚待研究。

5 结语

紫外线是引起皮肤急慢性损伤和皮肤癌症的主要因素，紫外线照射可以引起多条信号转导通路异常。蛋白质作为生物体组成所必需的物质，参与细胞构成，对机体生命活动十分重要。紫外线照射产生ROS，而ROS产生过量的自由基使得蛋白质氧化发生蛋白氧化应激，Nrf2被激活，并通过调节抗氧化酶类和Ⅱ相解毒酶基因的表达，清除过多的自由基，保护蛋白质，增强机体抗氧化应激的能力。因此，研究Nrf2信号通路及其调控机制与蛋白氧化应激损伤的关联机制，能为蛋白氧化应激损伤导致的相关皮肤病研究带来新的方向。

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Nuclear factor-E2-related factor 2 signaling pathway and its role in oxidative protein damage caused by ultraviolet in skin

Jiang Na,Zhu Huilan.Guangzhou Institute of Dermatology,Guangzhou 510095,China Corresponding author:Zhu Huilan,Email:zhlhuilan@126.com

Ultraviolet（UV） radiation can induce the production of reactive oxygen species （ROS） and free radicals that are implicated in photodamage-related diseases such as skin photoaging and skin cancer.ROS and free radicals not only can oxidize proteins through attacking amino acid main and side chains,but also can activate the mitogen-activated protein kinase to produce matrix metalloproteinase （MMP） followed by the degradation of proteins such as collagen protein in cutaneous connective tissue,and finally lead to skin photodamage.Nuclear factor-E2-related factor 2 （Nrf2） signaling pathway is a key regulator of cellular response to oxidative stress.Under oxidative stress,Nrf2 is activated,and then removes excessive Nrf2 and free radicals by regulating the expressions of antioxidases and phaseⅡdetoxifying enzyme,protect proteins by inhibiting the secretion of MMP,and finally protect skin from damage by enhancing the ability against oxidative stress.Therefore,to learn the Nrf2 signaling pathway,its regulation mechanism and relationship with oxidative protein damage in skin may offer new directions for the treatment of photodamage-related skin diseases caused by oxidative protein damage.

Ultraviolet rays;Oxidative stress;Signal transduction;Nrf2

10.3760/cma.j.issn.1673-4173.2015.01.018

广东省自然科学基金面上项目（S2011010005956）；广东省医学科研基金（A2014592）；广州市医药卫生科技项目（2013A011131）

510095广州市皮肤病防治所（江娜、朱慧兰）；广州医科大学（江娜）

朱慧兰，Email:zhlhuilan@126.com

本文主要缩写：Nrf2：核因子E2相关因子2，Keap1：Kelch样ECH相关蛋白1，ARE：抗氧化反应元件，PKC：蛋白激酶C，MAPK：丝裂原活化蛋白激酶，ROS：活性氧，MMP：基质金属蛋白酶

2014-01-28）