UPLC-MS/MS快速测定甘蓝类蔬菜中活性成分莱菔硫烷

李占省，刘玉梅*，方智远，杨丽梅，庄 木，张扬勇，李凌云，吕红豪，孙培田

(1．中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京100081;2．农业部蔬菜品质监测检验中心，北京100081)

十字花科芸薹属蔬菜(Brassica oleracea)如甘蓝、白菜、青花菜、花椰菜、芥蓝、苤蓝等含有丰富的粗纤维、蛋白质、维生素C和一些矿物质如钙、磷、铁、锌等。其中，芸薹属甘蓝类蔬菜如青花菜、甘蓝、羽衣甘蓝等还含有一种抗癌活性成分——莱菔硫烷(Sulforaphane，SF)(图1)。莱菔硫烷分子量为177．29，是一种异硫氰酸盐类物质。它在蔬菜中以4-甲亚磺酰基丁基硫甙(Glucoraphanin，GRA或RAA)的形式存在于植物液泡中。GRA自身并无生物活性，只有当细胞遭到破坏时才与细胞基质中黑芥子酶发生水解反应，生成莱菔硫烷［1－2］。研究表明，莱菔硫烷能够显著降低多种癌症的发病率如胃癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌和肺癌等。此外，它在治疗近视、老年痴呆和心脑血管疾病方面也有一定的功效［3－10］。

图1 莱菔硫烷结构式

莱菔硫烷的检测方法有气相色谱(GC)、气相色谱－质谱(GC-MS)和高效液相色谱(HPLC)［11－12］。目前，人们多采用HPLC法测定莱菔硫烷含量，但莱菔硫烷在高温下不稳定且易降解，所以GC和GC-MS法逐渐被HPLC替代。由于HPLC法往往需要较长的洗脱时间或冲洗时间，检测比较耗时［13］。因此，建立一种快速、准确检测蔬菜中莱菔硫烷的方法，对于提高工作效率和减少试剂消耗具有重要价值。笔者采用酶解－萃取法提取莱菔硫烷，以甲醇和水为流动相，建立一种快速检测莱菔硫烷的超高效液相色谱－串联质谱法(UPLC-MS/MS)。

1 材料与方法

1．1 试验材料 莱菔硫烷标准样品购于美国LKTTM，纯度大于98%。将10 mg标准品用甲醇(HPLC)定容到10 ml棕色容量瓶中，配制成1 000 mg/L的母液，在－20℃低温、避光保存。根据需要吸取一定量的母液，将其分别稀释成0．1、0．5、1．0、5．0、10．0 和 20．0 μg/L 系列标准液。

1．2 样品采集 甘蓝类蔬菜被栽培于中国农业科学院蔬菜花卉研究所试验基地。分别对甘蓝类蔬菜可食性部分(商品器官)进行取样，即甘蓝(叶球)4份、青花菜(花球)4份、芥蓝(花薹)4份和苤蓝(球茎)4份。取样后，将其去杂、擦干，然后根据需要将一定量样品进行液氮处理，真空冷冻、干燥。

1．3 样品前处理 将真空冷冻、干燥好的样品统一机械粉碎成粉末，精确称取干燥样品0．5 g，按照料液比为1∶30的比例加入pH为7．0的缓冲液(磷酸二氢钾和磷酸氢二钾配制，0．1 mol/L)，在室温下酶解1．5 h，加入30 ml乙酸乙酯进行萃取，5 500 r/min离心10．0 min，收集上清液，重复萃取2次后合并3次萃取液，将萃取液在35℃下旋转蒸干，最后用10．0 ml甲醇定容，过滤膜(0．22 μm)，低温 －20 ℃保存。

1．4 色谱－质谱条件

1．4．1 色谱条件。Waters BEH 反相 C18(2．1 mm × 50．0 mm，1．7 μm)，柱温30 ℃，流速0．25 ml/min，进样量10 μl，流动相为甲醇和水。方法为梯度洗脱，即B泵(甲醇)初始浓度为40%，A泵为60%，10 min时B泵变为100%，13 min时变为40%，A泵又重新变为60%，结束此次进样。

1．4．2 质谱条件。电喷雾离子源ESI(+)，毛细管电压为3．0 kV，离子源温度为110℃，脱溶剂气温度为350℃，脱溶剂气流量为500 L/h，锥孔反吹气流量为50 L/h。检测模式为多反应监测扫描模式(MRM)，见表1。保留时间为2．17 min。

表1 多反应监测

2 结果与分析

2．1 样品提取条件的优化 莱菔硫烷具有旋光性，在高温和强酸碱条件下极不稳定［14］。莱菔硫烷前体GRA在不同的pH条件下生成的次生代谢产物不同，在pH 3．0～5．0时以腈类为主，在中性条件下以异硫氰酸酯类为主，而莱菔硫烷就属于该组分，在偏碱条件下以硫氰酸酯类为主，因此要提高莱菔硫烷的生成量，就必须严格控制酶解条件的pH环境［15－16］。

对莱菔硫烷萃取剂的选择，多采用乙酸乙酯［17］。该研究对乙酸乙酯、乙腈和二氯甲烷等有机溶剂展开了研究。乙腈与水互溶，分离比较困难;二氯甲烷具有中等毒性，微溶于水，与水接触后会缓慢释放出氯化氢气体，且其浓度比水大，分离繁琐;乙酸乙酯为萃取剂，不但可以降低成本和毒性，其浓度比水小，不溶于水，易收集上清液。从表2可以看出，乙酸乙酯加样回收率为94% ～97%，能够满足试验和生产需要。

2．2 色谱柱的选择 莱菔硫烷是一种饱和异硫氰酸盐，而流动相中甲醇浓度始终≥40%。Waters BEH反相C18(2．1 mm×50．0 mm，1．7μm)柱具有较好的峰对称性和稳定的柱效。1．7μm柱是通用的超高效液相色谱柱，具有较好的pH适应性，能够在1．0～12．0的范围内进行分离。三键键合式烷基柱使其具有较好的选择性和灵敏度。该研究表明，Waters BEH C18柱能够很好地分离和检测目标成分。

2．3 色谱条件的选择 常用的流动相有甲醇和水、乙腈和水。该研究采用梯度洗脱的方法，研究流动相分离莱菔硫烷的效果。从保留时间、杂质干扰程度、峰形和基线漂移等方面进行比较，发现在流速为0．25 ml/min，洗脱程序如表1所述条件下，莱菔硫烷能够快速地被分离和检测，保留时间为2．17 min，峰形对称，无杂质干扰(图2)。因此，最终选用甲醇和水作为流动相。

图2 样品中莱菔硫烷的MRM图谱

2．4 质谱条件的选择 将莱菔硫烷的标准液直接进样后全扫描，找出目标的分子离子峰，对其轰击产生子离子。在MRM模式检测条件下，将分子离子和1～2个信号强度适宜的子离子组成监测离子对，使得特征例子的丰度和比例达到最优。

2．5 线性范围和检出限 将系列标准液(0．1、0．5、1．0、5．0、10．0和20．0 μg/L)进行测定，以峰面积(Y)为纵坐标，以浓度为横坐标进行回归分析，获得线性方程。结果表明，线性方程为 Y=3．69e－4X － 1．27，R2=0．999 4，标准偏差为2．4%(RSD，n=6)，可见线性方程良好。根据前处理过程，计算出仪器检出限(LOD，S/N=3)为0．06 ～0．15 μg/L，定量下限(LOQ，S/N=10)为0．3 ～0．4 μg/L，表明该方法具有较高的灵敏度，能够进行莱菔硫烷的准确检测。

2．6 准确度和精密度 分别以1．0和5．0μg/L 2个浓度进行加样，测定回收率和精密度。从表2可以看出，莱菔硫烷加样回收率为94% ～97%，相对标准偏差为0．6% ～1．2%，表明该方法准确度和精密度较好。

2．7 样品测定 根据建立的UPLC-MS/MS检测体系，对甘蓝类蔬菜4个变种共计20份材料进行测定。从表3可以看出，在供试材料中均检测到莱菔硫烷成分，且变种材料间存在差异。检测结果表明，在4种甘蓝变种中莱菔硫烷含量平均值分别为 38．65、376．54、151．31 和 133．79 mg/kgDW，可见青花菜花球中平均含量最高，甘蓝叶球中含量最低，芥蓝和苤蓝含量间差别不大。

表2 莱菔硫烷回收率的测定

表3 蔬菜样品中来莱菔硫烷含量mg/kgDW

3 结论

该研究用Waters BEH C18柱，以甲醇和水为洗脱溶剂，采用梯度洗脱的方法可准确、快速分离目标物莱菔硫烷，峰形对称。该方法准确可靠，快速灵敏，能够满足在蔬菜中快速检测莱菔硫烷的需要。研究表明，在4个甘蓝类蔬菜变种中均能检测到莱菔硫烷成分，甘蓝叶球中莱菔硫烷含量为20．46 ～58．05 mg/kgDW，青花菜花球中含量范围为85．17 ～607．95 mg/kgDW，芥蓝花薹中含量范围为 45．59 ～210．12 mg/kgDW，苤蓝球茎中含量范围为 40．51～205．33 mg/kgDW，可见该法能够满足试验和生产需要。

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