雪里见中草酸钙针晶形态结构与含量

刘育辰　刘刚　张勇　黄仕清　徐文芬　王进喜　杜江

摘要：利用显微镜和电镜观察雪里见（Arisaema rhizom C.E.C.Fisch）中草酸钙针晶的形态，并采用RP-HPLC法测定草酸钙的含量。结果表明，草酸钙针晶细长，具有尖锐的针尖；草酸在0.099 64～1.992 80 g/L范围内线性关系良好（r=0.999 3）；平均回收率为100.23%，RSD为1.52%。草酸钙针晶显微结构与同科植物的基本相同，建立的含量测定方法操作简便，结果可靠，重复性好，可作为雪里见药材质量控制的方法。

关键词：雪里见（Arisaema rhizom C.E.C.Fisch）；草酸钙针晶；显微结构；反相高效液相色谱法

中图分类号：R282 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）01-0094-03

雪里见为天南星科植物雪里见（Arisaema rhizom C.E.C.Fisch）的根茎，别名大半夏、麻脚狼毒、半截烂、躲雷草、避蛇参等。贵州、云南、四川等地的土家族和苗族将其作为治疗风湿麻木、跌打伤痛的要药。虽然雪里见在治疗某些顽固疾病和常见病方面具有独特疗效，但它对皮肤和黏膜具有强烈的刺激性[1]。2010年版《中国药典》收载的天南星科药材中，凡具有毒性或刺激性的药材都含有草酸钙针晶，而且国内也有学者对天南星科植物半夏[Pinellia ternata（Thunb.）Breit]、虎掌南星（Pinellia pedatisecta Schott）、天南星[Arisaema eruberscens（Wall.） Schott]及白附子（Typhonium giganteum Engl.）进行了研究，认为刺激性成分可能是其具有特殊晶型的“毒针晶”，其“毒针晶”成分除了含有草酸钙外，还含有蛋白质和微量糖类成分[2-4]。

目前对雪里见的研究多集中在药材鉴定、化学成分、药理活性等方面[5-8]，对其毒性成分研究较少，郭坤坤等[1]在前期的研究工作中，推断雪里见对皮肤和黏膜的刺激性来自草酸钙针晶。为此，拟从观察雪里见中草酸钙针晶的形态和测定雪里见中草酸钙针晶的含量着手，通过与同科药材中草酸钙针晶形态的比较，并建立一个简便、准确测定草酸钙针晶含量的方法，以期为后续开展炮制对雪里见中草酸钙针晶形态结构、含量的影响及炮制机理研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

药材：雪里见药材经贵阳中医学院杜江教授鉴定为天南星科植物雪里见的根茎。

试剂：草酸对照品（贵州迪大生物科技有限公司，纯度≥98%）；磷酸二氢钾、磷酸、盐酸、冰醋酸、甘油为分析纯；水为娃哈哈纯净水。

仪器：Agilent 1100高效液相色谱仪（四元梯度泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器）；XS205型十万分之一分析天平（瑞士METTLER TOLEDO）；HS10260D型超声波清洗器（天津恒奥）；HI98107型pH计（意大利HANNA）；爱国者数码显微镜EV5610；HUS-5GB型高真空镀膜机（日本HITACHI公司）、JFC-1600型离子溅射仪（日本JEOL公司）、JSM-6490LV型扫描电子显微镜（日本JEOL公司）。

1.2 方法

1.2.1 草酸钙针晶形态观察

1）显微观察样品制备。将样品粉碎，用冰醋酸-甘油-水（V/V，1∶1∶1）封片，于光学显微镜下观察并拍照。

2）扫描电镜样品制备。将样品粉末用胶带粘置观测台上，于HUS-5GB型高真空镀膜机中进行高真空镀碳膜，再于JFC-1600型离子溅射仪中镀铂金膜，在电流100 HA、加速电压20 kV的条件下扫描、观察并进行显微拍照。

1.2.2 草酸钙含量测定

1）色谱条件及系统适应性试验。色谱柱Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相：0.5%KH2PO4-H3PO4水溶液（pH 2.3），流速0.8 mL/min，检测波长210 nm，柱温22 ℃，进样量10 μL。

2）草酸对照品溶液的配制。称取草酸对照品适量，精密称定，加去离子水配制成1.992 80 g/mL的草酸溶液，作为对照品储备液。

3）供试品溶液的制备。取雪里见粉末0.4 g置于离心管中，加入去离子水3 mL，混匀，超声处理10 min，置70 ℃水浴锅中加热，并搅拌10 min，4 000 r/min离心5 min，取上清液，残渣以热去离子水洗涤3次，每次2 mL，混匀，离心，合并上清液，然后加盐酸（体积比1∶1）溶液0.4 mL，去离子水3 mL，混匀，方法同上，分离沉淀与上清液，沉淀用0.1 mol/L的HCl同上法处理2次，每次2 mL，离心，合并上清液定容至10 mL量瓶中，备用[9]。

1.2.3 标准曲线的绘制 精密吸取草酸对照品溶液适量，依次用去离子水稀释成0.099 64、0.199 28、0.498 20、0.797 20、0.996 40、1.992 80 g/L的对照品溶液，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液10 μL注入液相色谱仪。以对照品进样浓度（g/L）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：■=7 038.8 x+242.95，r=0.999 3。结果表明草酸在0.099 64～1.992 80 g/L范围内线性关系良好。

2 结果与分析

2.1 草酸钙针晶形态观察结果

从图1和图2可以看出，雪里见的草酸钙针晶细长，具有尖锐的针尖，多是单个散在，很少成束，长短不一，晶体有的表面光滑，有的具有小的突起，有的表面还具有凹槽。

2.2 草酸钙含量测定结果

2.2.1 对照及样品色谱图 对照及样品色谱图见图3。endprint

2.2.2 精密度试验 精密吸取草酸对照品溶液（浓度0.498 20 g/L）10 μL，重复进样6次，测定草酸峰面积，计算并折算成样品中草酸钙含量，其RSD为0.76%，表明仪器精密度良好。

2.2.3 重复性试验 取同一批号样品，平行制备供试品溶液6份，分别进样10 μL，测定草酸峰面积，计算并折算成样品中草酸钙含量，其RSD为1.18%，表明试验的重复性良好。

2.2.4 稳定性试验 精密吸取同一份供试品溶液10 μL，分别于0、2、4、6、8、12 h进样，测定草酸峰面积，计算并折算成样品中草酸钙含量，其RSD为0.15%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.2.5 准确度 采用加样回收法。精密称取已测定含量的雪里见样品粉末6份各约0.2 g，分别加入草酸对照品适量，按“1.2.2”的制备方法及色谱条件测定，计算并折算成样品中草酸钙含量，计算加样回收率和RSD值，结果见表1。结果表明试验准确度良好。

2.2.6 样品含量测定 取样品制备供试品溶液，RP-HPLC测定，计算并折算成样品中草酸钙含量，具体见表2。

3 小结与讨论

3.1 雪里见中草酸钙的显微形态

从雪里见草酸钙针晶的电镜扫描图可以看出，与同科的半夏、虎掌南星、天南星及禹白附药材的针晶形态相似[4]，针晶都是极为细长，具有尖锐的针尖，但其表面有的比较光滑，有的具有小的突起，有的还具有凹槽，其具体原因有待进一步研究。有文献报道，粉碎粒度对草酸钙针晶的形态、数量和存在的方式有所改变[10]，因此建议考察粉碎粒度对雪里见中草酸钙形态的影响。由于雪里见有毒，一般需要炮制后使用，建议考察不同炮制方法对其草酸钙形态的影响。

3.2 雪里见中草酸钙的含量测定

草酸钙针晶不溶于水及有机溶剂，因此对样品进行简单处理，先将可溶性的草酸盐去除，然后再通过酸处理使草酸钙转化为草酸，再采用RP-HPLC法测定草酸的含量并换算成药材中所含有的不溶性草酸钙针晶的含量[2，3，5]。

分别对流动相组成、流动相pH、流速、柱温、检测波长进行了考察，结果表明，以0.5% KH2PO4-H3PO4水溶液作为流动相且pH为2.3时，流速0.8 mL/min，柱温22 ℃，检测波长210 nm时色谱峰信号强，且分离度良好，基线平稳。

虽然天南星科药材中都含有草酸钙针晶，但含量差别很大，半夏、水半夏、白附子、天南星中草酸钙的含量分别为1.222 8%、1.147 2%、0.668 5%、0.688 6%[11]，而雪里见中草酸钙针晶的含量都在2%以上，天南星科药材中草酸钙针晶的含量与其毒性是否存在相关性还有待进一步研究。试验采用RP-HPLC法测定雪里见中草酸钙针晶含量，该方法简便、易行、快速，结果准确可靠，可作为雪里见药材质量控制的方法。同时该方法为后期比较雪里见药材炮制前后草酸钙针晶含量影响及机理研究打下了基础。

参考文献：

[1] 郭坤坤，杜 江.民族药雪里见的毒性分析[J].中国民族医药杂志，2009，7（7）：49-51

[2] 郁红礼，吴 皓，朱法根.天南星科4种有毒中药毒针晶糖类成分的单糖组成分析[J].南京中医药大学学报，2010，26（3）：193-195

[3] 葛秀允，吴 皓.天南星科有毒中药毒针晶的组成成分分析[J].药物分析杂志，2010，30（2）190-193.

[4] 吴 皓，葛秀允，郁红礼，等.天南星科4种有毒中药针晶的晶型结构和其毒性的比较[J].中国中药杂志，2010，35（9）：1152-1155.

[5] 陈声晶，陈龙全.民族药雪里见的薄层鉴别研究[J].时珍国医国药，2010，21（7）：1743.

[6] 周 杰，国兴明，徐裕彬，等.贵州中药雪里见化学成分分离和纯化的初步研究[J].山地农业生物学报，2005，24（3）：265-267.

[7] 张国安.民族药雪里见的生长特性与理化特性研究[J].湖北民族学院学报（医学版），2002，19（1）：27-29.

[8] 陈春霞.民族药材雪里见的生物活性及化学成分研究[D].武汉：华中科技大学，2012.

[9] 旺晓莉，唐力英，王祝举，等.天南星中草酸钙针晶的含量测定[J].中国实验方剂学杂志，2010，16（11）：30-31.

[10] 肖碧英，李先端，格小光，等.超微粉碎对白附子中草酸钙针晶形态和数量的影响[J].时珍国医国药，2011，22（1）：84-85.

[11] 钟凌云，吴 皓.RP-HPLC测定天南星科药用植物中草酸钙针晶的含量[J].中成药，2008，30（2）：260-262.endprint