分子标记辅助筛选携带Xa23、Stvb—i、Pi—1抗病基因的水稻种质资源

孙海波+邹美智+任洪岩+王景余+李艳萍+冯瑞光

摘    要：利用分子标记辅助选择技术对62份水稻种质资源进行筛选携带Xa23、Stvb-i、Pi-1抗病基因种质资源。结果表明：经PCR检测，从中选择出含两种抗病基因的材料有10个，占16.1%，其中Xa23和Pi-1呈阳性的材料有4个，Xa23和Stvb-i呈阳性的材料有1个，Pi-1和Stvb-i呈阳性的材料有5个;含有一种抗病基因材料40个，占64.5%，其中Xa23呈阳性的材料有3个，占4.8%;Pi-1呈阳性的材料有17个，占27.4%;Stvb-i呈阳性的材料有20个，占32.3%;本试验为实现分子标记辅助选择水稻抗病育种打下了坚实的基础。

关键词：水稻种质资源;分子标记辅助选择;抗病;Xa23;Stvb-i;Pi-1

中图分类号：S511          文献标识码：A           DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.04.001

Screening the Rice Germplasm Containing Disease-resistant Genes Xa23， Stvb-I， Pi-1 by Molecular Marker-assisted Method

SUN Hai-bo，ZOU Mei-zhi，REN Hong-yan，WANG Jing-yu，LI Yan-ping，FENG Rui-guang

（Tianjin Crops Research Institute， Tianjin 300384，China）

Abstract：In the study， the rice germplasm containing disease-resistant genes Xa23， Stvb-i， Pi-1 was screened from 62 anther culture descendants by molecular marker-assisted method. The results showed that 10 rice cultivars having two disease resistant genes was obtained， which was 16.1%. Among them， 4 cultivars contained Xa23 and Pi-1， one cultivar had Xa23 and Stvb-I， and 5 cultivars contained Pi-1 and Stvb-i. There are 40 cultivars carrying one disease resistant gene， which was 64.5%. In which 3 cultivars carried Xa23 （4.8%）， 17 ones carried Pi-1 （27.4%） and 20 ones had Stvb-i （32.3%）. Such findings in the paper provided basis for breeding of disease-resistant rice by molecular marker-assisted method.

Key words： rice germplasm;marker-assisted selection;resistance;Xa23;Stvb-i;Pi-1

病害是水稻高产稳产的重要限制因子。在水稻生产中，白叶枯病、稻瘟病和条纹叶枯病，广泛发生在全国各个稻区，流行年份一般减产10%～20%，重者高达40%～50%，甚至绝收 [1]。实践证明，选育和应用水稻抗病品种，利用其自身的抗病性是目前防治水稻病害的最经济、最有效的措施[2]。因此，为了高效地培育出抗病品种，开展水稻抗病基因型分子标记辅助选择，充分利用抗病基因的表达来防止和控制这三大病害的发生，具有实际意义。

分子标记辅助选择是直接通过与目的基因紧密连锁的分子标记来选择基因型[3]，因其不易受环境影响，选择结果科学可靠，并可以在早代进行选择，故被广泛地用于水稻白叶枯病、稻瘟病、条纹叶枯病等抗病育种中，已成为水稻抗病育种的一个重要辅助手段。Xa23是一个来自普通野生稻的抗白叶枯病、抗谱最广、全生育期抗性导入效应强的完全显性基因[4]，已报道常用的Xa23标记主要有RM206[5]、C189[6]等。Pi-1是一个来源于籼稻品种AC23中的具广谱抗性的显性抗稻瘟病基因[7]，已报道常用的Pi-1标记主要有MRG4766[8]、RM144[9]等;Stvb-i是一个显性的全生育期高抗条纹叶枯病基因[10]，已报道常用的Stvb-i标记主要有ST10[11]、RM11-8[12]等。

本研究试图利用分子标记技术辅助选择携带抗Xa23、Stvb-i、Pi-1三种病害基因的种质资源，以期掌握水稻种质资源是否含有抗病基因，为分子设计水稻抗病育种提供科学依据。

1    材料和方法

1.1    试验材料

阳性植株对照亲本分别为携带抗白叶枯病Xa23基因的水稻材料BG152、携带抗稻瘟病Pi-1基因的水稻材料R118（由中国农业科学院作物科学研究所提供）和携带抗条纹叶枯病Stvb-i基因的花育409，以及从天津、北京、辽宁、江苏等省市引进或自育水稻种质资源59份。

1.2    试验方法

1.2.1    种植方式    每份资源同期播种、插秧，插3行区，每行9穴，每穴单株，株行距为13.3 cm×30 cm。田间管理同一般水田。

1.2.2    PCR检测

1.2.2.1    DNA提取及引物的合成    在分蘖期对引进的水稻种质资源，采用简易SDS抽提法[5]提取单株水稻幼嫩叶片DNA。

按文献检阅[5，8，12]，设计与目的基因紧密连锁的分子标记（表1）。引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2.2.2    PCR扩增    PCR反应体系为20 μL，包括2 μL 10×Buffer（含20 mmol·L-1 Mg2+），10～30 ng 模板DNA，0.2 mmol·L-1 dNTP（2.5 mmol·L-1），正向和反向引物各0.2 μmol·L-1，1 U Taq酶，ddH2O补至20 μL。

PCR反应条件为94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循环35次，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.2.2.3    电泳    每管PCR扩增产物加2 μL的溴酚蓝（含0.25%溴酚蓝、40%蔗糖水溶液）混匀，点入8%聚丙酰胺变性测序凝胶上电泳，EB染色显带，记录结果。其中含有目的基因带型记为“+”，不含目的基因带型的记为“-”。

2    结果与分析

2.1    Stvb-i的PCR检测

用携带抗条纹叶枯病Stvb-i基因的花育409作阳性植株对照，利用与Stvb-i基因紧密连锁的分子标记对61份水稻种质资源进行PCR检测，其 PCR检测结果见表2。从表2可以看出，从61份水稻种质资源中筛选出含抗条纹叶枯病Stvb-i基因的26份，分别为GQ-C2、GQ-C3、GQ-C4、GQ-C6、GQ-C9、海平稻选、07-15、SX867、LD30、LD12、ZD99、ZD9424、ZD88、XYG200、ZF9号、YJ689、H028、WYJ8号、XD3号、XD5号、XA931、ZD18、ZD19、LJ6号、LJ7号、LJ9号等。

2.2    Xa23的PCR检测

用携带抗白叶枯病Xa23基因的中间材料BG152作阳性植株对照，利用与Xa23基因紧密连锁的分子标记对61份水稻种质资源进行PCR检测，其 PCR检测结果见表2。从表2可以看出，从61份水稻种质资源中筛选出含抗白叶枯病Xa23基因的7份，分别为皖香早稻、GQ-C6、GQ-C11、CA1、W21621、HD5号、W0625-5等。

2.3    Pi-1的PCR检测

用携带抗稻瘟病Pi-1基因的水稻材料R118作阳性植株对照，利用与Pi-1基因紧密连锁的分子标记对61份水稻种质资源进行PCR检测，其 PCR检测结果见表2。从表2可以看出，从61份水稻种质资源中筛选出含抗稻瘟病Pi-1基因的27份，分别为GQ-C3、GQ-C5、GQ-C7、GQ-C8、GQ-C11、JD263、JD1007、LP-104、07-15、09XB107、W21621、LD12、WXJ21号、ZD99、ZD9424、W2845、WLJ1号、HD5号、YD8号、WYJ3号、WXJ14号、JH香稻、W0625-5、XA931、XXF2号、XF2号等。

2.4    水稻种质资源的PCR检测统计

62份水稻种质资源的PCR检测统计见表3。

从表3可以看出，62份水稻资源经PCR检测，从中筛选出含有一种抗病基因资源40份，占64.5%，其中Xa23呈阳性的材料有3份，占4.8%;Pi-1呈阳性的材料有17份，占27.4%;Stvb-i呈阳性的材料有20份，占32.3%。含两种抗病基因的资源有10份，占16.1%，其中Xa23和Pi-1呈阳性的材料有4份，Xa23和Stvb-i呈阳性的材料有1份，Pi-1和Stvb-i呈阳性的材料有5份。无目的基因的资源有12份，占19.4%。

3    讨 论

选择是水稻育种中的重要环节。传统的水稻育种选择方法是对符合育种目标的农艺性状如株高、穗数、穗粒数、米质、抗逆、抗病等进行直接选择，即是通过个体表现型间接对基因型进行选择，而不是对基因型进行直接选择。一般而言，这种方法对质量性状的选择是有效的，对数量性状的选择，由于存在一因多效、多因一效等作用，个体的表现型与基因型存在较大的差异，尤其是水稻的抗病育种，通过田间表现型进行个体选择的准确性较低[13-15]。分子标记辅助选择技术是利用与目标基因紧密连锁或共分离关系的分子标记对选择个体进行目标区域以及全基因组筛选，从而减少连锁累赘，获得期望的个体，达到提高育种效率的目的。利用分子标记辅助选择已应用于水稻抗病育种的实践中，并取得一些实质性进展。在聚合多个单一病害抗性基因方面：邓其明等[16]利用分子标记将3个抗白叶枯病基因Xa21、Xa4和Xa23聚合到绵恢725中。秦刚等[17]利用分子标记技术将水稻白叶枯病基因Xa4、Xa23进行了聚合，并成功获得聚合体。柳武革等[18]通过杂交、回交和自交并结合分子标记辅助选择，将Pi-1、Pi-2基因导入温敏核不育系GD-7S中，获得5个携带两个抗性基因的纯合改良不育株系。陈红旗等[19]利用分子标记技术聚合抗稻瘟病基因Pi-1、Pi-2、Pi-33，获得6个金23B导入系。在聚合多个不同抗病基因方面：倪大虎等[20]利用分子标记辅助选择聚合高抗白叶枯病的Xa23基因和高抗稻瘟病Pi9（t）基因，获得了汉川基因的优良株系L10～L13。倪大虎等[21]通过分子标记辅助选择与传统的杂交、自交相结合的方法，将抗稻瘟病的Pi9（t）基因和抗白叶枯病的Xa21、Xa23基因聚合到同一株系中，经多代大田或和温室接菌鉴定、室内标记选择和田间农艺性状的筛选，获得了4个三基因聚合且农艺性状优良的株系。Sugiura等[22]利用分子标记辅助选择将水稻条纹叶枯病基因Stvb-i和抗稻瘟病基因pb1聚合，选育出新的双抗水稻品种爱知106。王军等[23]利用分子标记辅助选择聚合水稻抗稻瘟病基因Pi-ta、Pi-b和抗条纹叶枯病基因Stvb-i，选育出高产、优质、多抗水稻新品系74121。

本研究利用分子标记辅助选择技术，快速高效地筛选出了含广谱显性抗白叶枯病Xa23基因、抗稻瘟病Pi-1基因和抗条纹叶枯病Stvb-i基因的水稻种质资源，从中筛选出含有一种抗病基因资源40份，占64.5%，其中Xa23呈阳性的材料有3份，占4.8%;Pi-1呈阳性的材料有17份，占27.4%;Stvb-i呈阳性的材料有20份，占32.3%。含两种抗病基因的资源有10份，占16.1%，其中Xa23和Pi-1呈阳性的材料有4份;Xa23和Stvb-i呈阳性的材料有1份;Pi-1和Stvb-i呈阳性的材料有5份，为今后作为水稻抗性育种的骨干亲本，实现分子标记辅助选择水稻抗病育种奠定了坚实的物质基础。

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