3种检测生殖器疱疹方法的对比研究

张 帆，莫银娟，朱丽婷(南方医科大学珠江医院皮肤科，广州 510282)



·论 著·

3种检测生殖器疱疹方法的对比研究

张 帆，莫银娟，朱丽婷
(南方医科大学珠江医院皮肤科，广州 510282)

目的 寻找更为准确、经济、实用的生殖器疱疹病毒感染的检测方法。方法 取根据病史及典型的临床症状表现的生殖器疱疹疑似病例患者标本50例，分别采用病毒培养、荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)及酶联免疫吸附试验(ELISA) 3种方法进行实验室检测，比较各种方法检测的阳性率。结果 病毒培养阳性30例，阳性率60.0%；FQ-PCR检测阳性34例，阳性率68.0%；ELISA检测阳性32例，阳性率64.0%，经χ2检验，三者差异无统计学意义(χ2=0.69，P>0.05)。水疱和脓疱标本的阳性率分别为94.6%和83.3%，明显高于其他来源标本的阳性率。结论 3种检测方法对临床疑似生殖器疱疹患者的检测阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。相对另外两种检测方法，ELISA因其便宜、实用的优点而适用于临床推广应用。水疱和脓疱标本阳性率明显高于其他类型标本的阳性率，对临床疑似病例的实验诊断，标本以采集水疱和脓疱液为佳。

生殖器疱疹； 病毒培养； 荧光定量聚合酶链反应； 酶联免疫吸附试验

单纯疱疹病毒(HSV)包括HSV-1和HSV-2两个血清型，HSV感染引起疱疹性口腔炎、眼炎、脑炎及生殖器炎等诸多临床表现[1]。而生殖器疱疹是临床最常见的一种性传播疾病，具有反复发作及癌变特性，对患者的身心健康构成严重威胁[2-4]。引起生殖器疱疹的主要病毒类型为HSV-2，约占90%[5]，HSV-1和混合型只占很少的一部分。本文主要研究的是检测HSV-2感染。该病的诊断主要依据临床表现，结合实验室检测。目前，HSV-2的实验室诊断方法主要有病毒分离培养、聚合酶链反应(PCR)、酶联免疫吸附试验(ELISA)及血清抗体检测等方法。其中，病毒分离培养为“金标准”。但病毒培养操作难度大，时间周期长(一般需要4～7 d)，条件要求严格，很难在临床推广。而荧光定量PCR(FQ-PCR)检测结果特异性和敏感性都高，但费用昂贵。作者采用3种检测方法对50例生殖器疱疹临床标本进行检测并对比分析，以帮助找到一种适合于临床实验广泛应用的有效检测HSV-2的方法。

1 资料与方法

1.1 标本采集 临床疑似生殖器疱疹患者50例均来自2014年8月至2015年2月珠江医院皮肤科门诊就诊患者，其中男37例，女13例；年龄19～56岁。具有临床症状的患者先暴露皮损部位，采集疱液、脓疱液或溃疡面痂面皮屑；无临床症状的患者，男性采集前2 h内未排尿，尿道口内1～3 cm取材，女性宫颈口内1～3 cm取材。

1.2 病毒分离培养

1.2.1 细胞培养 培养病毒细胞采用A549(肺腺癌细胞)，来自The American Type Culture Collection (ATCC)。A549使用含10%胎牛血清(Hyclone公司)的低糖DMEM培养液(美国Invitrogen公司)，置于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养，胰酶消化，转至24孔细胞培养板，培养至单层。

1.2.2 临床标本接种 将病毒运送液摇匀，取0.2 mL经处理标本接种于细胞培养基中，在37 ℃、5%CO2的培养箱中培养1 h，以便病毒吸附，然后加入2 mL含2%胎牛血清的完全培养基，36 ℃、5%CO2的培养并观察细胞形态改变。

1.2.3 细胞观察 将培养物反复冻融3次，取0.2 mL培养物接种到新HEP-2细胞管中，经培养后，将HEP-2细胞管用吸管吹打下来，以200×g离心10 min，弃上清液，将沉淀混悬液加入100 mL、pH 7.2的PBS中，取25 mL滴于载玻片上，并涂成1 cm圆膜，干燥后，丙酮固定10 min，用HSV单克隆抗体(达科生物技术有限生物公司)染色，荧光显微镜观察。

1.3 FQ-PCR检测

1.3.1 DNA模板制备 试剂购自达安基因股份有限公司。用无菌生理盐水洗脱拭子的分泌物或疱液。10 000×g离心10 min，弃上清液，沉淀加50 μLDNA提取液，100 ℃干浴10 min，10 000×g离心5 min，取5 μL上清液作PCR扩增模板。

1.3.2 引物设计 设计引物序列为P1：5′-AGGAGTGGCTGGCGCGACC-3′；P2：5′-ATCCGGTCCTTGATGGACG-3′。取5 μL模板提取液加入到HSV-2反应管中，各反应管放入LIGHTCYCLER型PCR仪中，扩增93 ℃ 2 min后93 ℃ 5 s，57 ℃ 45 s，40个循环后再37℃ 1 s。循环结束后，自动读取定量结果值。

1.4 ELISA检测 ELISA试剂盒购自DAKO公司。恢复至室温，取200 μL标本液加入96孔聚乙烯酸标板各反应孔，另取阴阳性对照各200 μL加入反应孔。各孔加酶结合物50 μL，37 ℃孵育90 min，洗涤4次，加底物A、B各100 μL，振荡30 min，加硫酸终止液100 μL，450 nm酶标仪测A值，A>CO+0.015为阳性，表示有疱疹病毒感染。

1.5 统计学处理 采用SPSS19.0进行统计分析，计数资料采用百分率表示，组间比较采用χ2检验，以α=0.05为检验水准，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

在50例标本中，经病毒培养法检测，30例阳性，阳性率60.0%。FQ-PCR检测阳性34例，阳性率68.0%。ELISA检测阳性32例，阳性率64.0%。3组检测方法阳性检出率差异无统计学意义(χ2=0.69，P>0.05)。

从取材的结果类型来看，水疱和脓疱标本检出的阳性率较高，分别为94.6%和83.3%，明显高于其他取材类型的标本阳性率(糜烂38.8%，痂面20.0%，拭子16.6%)。见表1。

表1 50例临床标本的病毒培养、FQ-PCR和ELISA的检测结果

3 讨 论

生殖器疱疹是由HSV感染泌尿生殖器及肛门周围皮肤黏膜而引起的一种慢性、复发性、难治愈的性病，该病临床表现多样，多发且具有致癌、致畸性。近年研究发现，生殖器疱疹患者较健康人更易感染HIV[6-7]。临床上典型病例可以根据病史和临床表现诊断，但很多病例临床表现不典型或处于亚临床感染状态，一些病例合并其他感染，如梅毒、尖锐湿疣及念珠菌等[8]，因此实验室检测对于生殖器疱疹的诊断非常必要。随着医学分子生物学的发展，生殖器疱疹实验室诊断方法亦有了很大发展，病毒培养法、抗原检测法、FQ-PCR及抗体检测法等相继应用于HSV感染的检测[9-10]。目前，病毒的分离培养法是国际公认的诊断生殖器疱疹的金标准，但操作复杂费时、技术要求高，并且分离培养的成功率与标本采集、标本中活病毒数量以及标本的运送和保存等多种因素有关[11]，难以成为检测HSV-2的临床常规方法。随着检测技术的进步，FQ-PCR逐渐取代传统的PCR检测法。FQ-PCR由于多使用了一条与模板互补配对的核酸探针，因此比传统PCR法具有更高敏感性和特异性[12]，同时减少了假阳性的概率。但FQ-PCR所需检测仪器价格昂贵，实验场所要求必须达到国家规定的PCR实验室条件，且实验操作人员必须经严格的岗前培训并具有相应的资质。而ELISA方法具有方便、快速及费用低等有点，且实验条件要求不高。国外研究证实，ELISA(DAKO试剂盒)检测疱疹病毒抗原有较高的敏感性和特异性[13]。在本研究中，作者发现3种检测方法对HSV-2的检测结果差异无统计学意义(P>0.05)，提示用相对简单的ELISA代替其他两种方法检测HSV-2的可行性。本试验中，还发现不同的标本来源，检测结果差异有统计学意义(P<0.05)，其中水疱和脓疱的标本阳性率明显高于其他类型的标本，提示水疱和脓疱中病毒的活力最强或处于病毒复制期，而其他类型标本中的活力明显减弱甚至消失。提示实验室检测生殖器疱疹，标本的采集最好为水疱或脓疱的疱液。

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Contrastive study on three methods in detection of genital herpes virus

ZHANGFan,MOYin-juan,ZHULi-ting
(DepartmentofDermatology,ZhujiangHospitalofSouthernMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510282,China)

Objective To search for a more accurate,economic and practical detection method of genital herpes virus (HSV).Methods 50 specimens were collected from the suspected as genital herpes according to the disease history and the typical clinical symptoms and tested by adopting 3 kinds of method:virus culture method，fluorescence quantitative-PCR (FQ-PCR) and ELISA.The positive rates were compared among 3 kinds of method.Results 30 cases were positive in the virus culture,the positive rate was 60.0%,34 cases were positive in FQ-PCR with the positive rate of 68.0%,32 cases were positive in ELISA with the positive rate of 64.0%,the differences were not statistically significant(χ2=0.69，P>0.05).However,the positive rates of blister and pustules specimens were 94.6% and 83.3% respectively,which were significantly higher than those of other sources of samples.Conclusion The positive rate of clinically suspected genital herpes detected by using three methods had no statistically significant difference.ELISA is more suitable for clinical application compared with other two methods because of cheap and convenient advantages.The positive rate of blister and pustules specimens is significantly higher than that of other types of samples,therefore in the laboratory diagnosis for the suspected case,collecting the blister and pustules samples is best.

genital herpes； virus culture； FQ-PCR； ELISA

张帆 男，副主任技师，硕士，主要从事皮肤性病检验和肿瘤病理研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.21.019

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1672-9455(2015)21-3182-02

2015-04-29

2015-06-24)