GSK-3底物竞争性抑制剂在神经系统疾病的研究进展

罗亨全

(江汉油田总医院精神卫生科，湖北潜江433124)

GSK-3底物竞争性抑制剂在神经系统疾病的研究进展

罗亨全

(江汉油田总医院精神卫生科，湖北潜江433124)

GSK-3抑制剂;中枢神经系统疾病;药物设计;L803-mts;阿尔茨海默病

糖原合成酶激酶-3（GSK-3）抑制剂已成为治疗神经退行性疾病和精神障碍性疾病的有效方法。尽管多种GSK-3抑制剂已经在细胞水平和动物模型试验中得到广泛运用，然而还需完善的是提高其特异靶向性。目前已经认识到对于长期用药来说选用中度效果的抑制剂比完全性抑制剂效果更佳。底物竞争性抑制剂具有高度选择性，并能适度调控抑制效率。现将近年来GSK-3底物竞争性抑制剂的在治疗方面的研究进展综述如下。

1 GSK-3在中枢神经系统的作用

糖原合成酶激酶-3（GSK-3）在中枢神经系统（CNS）中起着重要调控作用，这一认识得益于通过研究经典的情绪稳定剂锂离子的作用底物，发现它可以抑制GSK-3β的活性[1,2]，从而开启了GSK-3在精神系统功能的广泛研究。由于情绪行为的改变与神经系统疾病的关系密切，所以人们很快又转向了对于CNS中GSK-3信号通路的研究。研究证实GSK-3参与了多数神经退行性疾病的发生，譬如帕金森氏症、肌萎缩性侧索硬化症（ALS）、多发性硬化综合症、阿尔茨海默氏病（AD），以及脑髓老化等[3-6]。转基因小鼠中增强GSK-3活性导致记忆缺损、大脑萎缩、以及行为与交互能力减弱[7]，最终出现阿尔茨海默氏病的特征，譬如Tau蛋白高度磷酸化浓度及β淀粉样蛋白积聚[8]。药物抑制剂或选择性GSK-3基因敲除也证实GSK-3参与对于脑质形态、神经元可塑性以及精神行为的调控[6]。

目前在临床上也发现AD、ALS、多数抑郁症、精神分裂症和躁狂抑郁症患者都有GSK-3的活性调控的异常[6,7,9]，其发病机制可能与一些受GSK-3直接或间接调控的靶蛋白有关，包括tau蛋白、老素、β淀粉样蛋白、脑衰蛋白反应调节蛋白、Wnt信号通路、β-连环蛋白和热休克蛋白等[3,6]。近期研究表明GSK-3参与炎症反应，此一作用可能与神经退行性疾病有关。GSK-3可激活各种免疫应答通路，如Toll样受体，转录因子NF-кB，环状AMP反应元件结合蛋白，以及其他参与调节细胞因子产生的通路[10,11]。另外，最近发现GSK-3可负向调控溶酶体功能，降低其对神经毒性集聚体的清除，譬如AD大脑中的Aβ集聚体[12,13]。由此可见，使GSK-3活性回归正常化是治疗神经退行性疾病和行为障碍疾病的有效方法，并且已有多个动物模型证明GSK-3抑制剂有良好的疗效。

有关GSK-3小分子抑制剂的报道量在不断的增加，很多已经进行了动物体内试验，都证实在生理条件和病理状态下GSK-3都起着调控神经元的作用。GSK-3抑制剂在神经保护、干细胞自我复制和多能转化、神经触突调控和精神行为等方面都具有显著的保护作用[14]。目前公开发表的GSK-3抑制剂有不同的化学类型，而且作用机制各异：包括天然产物、金属阳离子、人工合成小分子化合物和多肽[14]。大多数抑制剂其作用机制是通过与GSK-3的ATP结合位点竞争性结合而抑制其对底物的磷酸化作用。因为多数蛋白激酶ATP结合位点属于高度保守的序列，ATP竞争性抑制剂通常特异性较差[15]，导致在临床前期或早期临床试验中，由于GSK-3抑制剂存在严重的毒副作用而失败，为此，在开发和设计特异性蛋白激酶抑制剂方面要有独创性。

GSK-3普遍存在于所有的真核细胞中，在哺乳动物中有GSK-3α和GSK-3β两种亚型，他们的催化区域氨基酸序列同源性高达98%，而蛋白两端的同源性仅36%，不过他们在功能方面具有高度共性[6,10]。在AD疾病模型中抑制GSK-3α比抑制GSK-3β的效果更好[16]，可能与他们有不同的亚细胞定位及与不同的蛋白相互作用有关。一般的GSK-3抑制剂并不能区分这两个亚型，但是最近已有具有高选择性GSK-3α抑制剂的报道[17]，但它们对于生理方面的影响还需进一步探索，显然，彻底阐明GSK-3同工酶的独特生理功能对开发全新特异性抑制剂将起到至关重要的作用。

2 底物竞争性GSK-3抑制剂

为了获得蛋白激酶特异性抑制剂，一种方法是根据底物结合位点的不同特征来实现对靶目标的选择性抑制。虽然针对底物结合位点来设计抑制剂的方法还没有得到广泛应用，但它不失为设计新型GSK-3抑制剂的好方法。长期以来，人们都认为底物竞争抑制剂的弱点是与靶蛋白结合能力较弱，但目前认为，结合能力较强的蛋白激酶抑制剂在体内应用系统中往往产生强烈不良反应。在需要长期给药的治疗过程中，适度抑制蛋白激酶的活性可能会获得所需的疗效，同时减少副作用的发生，在设计GSK-3抑制剂方面此点可能尤为突出。GSK-3是细胞维持正常功能所必须的，强效抑制剂往往导致细胞损伤，GSK-3基因敲除小鼠出现胚胎死亡已经证明了这一结论[18]。此外，GSK-3的病理性激活状态与正常水平相比增加不超过2～3倍，因此，在GSK-3活性升高相关的疾病中可能只需要抑制其活性到中等至更低（约50%）水平，而底物竞争性GSK-3抑制剂则具有高选择性和低毒性。

3 底物竞争性抑制剂的设计与开发

GSK-3和其它蛋白激酶相比存在许多不同，与设计特异性抑制剂相关的GSK-3独特性在于它要求底物的预磷酸化。GSK-3的底物都有共同的S1XXXS2(p)序列，其中S1位点被GSK-3磷酸化，S2是一个调节位点，需要先被其他激酶磷酸化，将S2(p)位点突变为磷酸化酪氨酸残基或谷氨酸能显著减少底物被GSK-3的磷酸化水平[19]。人源GSK-3晶体结构研究表明它含有一个由Arg96、Arg180和Lys205三个碱性氨基酸组成的结合域，它能与阳离子以及预磷酸化的底物相结合。另外一个很重要的酶活性调节区域是位催化活性区域内的酪氨酸的自磷酸化（GSK-3β中的酪氨酸216，GSK-3-α中的酪氨酸279），这个自磷酸化依赖于伴侣蛋白的辅助[20]。此外，其氨基末端区域有一个高度保守的序列（RPRTTSF），磷酸化后的这一保守序列充当赝品底物而导致激酶活性下降[21]。这三要素控制着GSK-3激酶活性，在设计抑制剂时要充分考虑这三个特点。

利用GSK-3识别预磷酸化底物的特点，可以使用人工合成多肽的方法设计底物竞争性抑制剂。依据GSK-3β氨基末端假底物序列衍生的磷酸化多肽对GSK-3抑制效用很弱[21]。相反，体外实验发现热休克蛋白-1衍生肽L803具有强效抑制作用[22]。在L803氨基末端附加肉豆蔻酸短肽后（L803-mts）使其具备细胞穿膜功能[22]、水溶性极好、GSK-3高选择性和血清稳定性强等特点。在小鼠动物实验中，组织病理学和单剂最大耐受量分析显示其毒性作用很小。体内实验和神经元细胞实验中L803-mts均有生物活性，对帕金森氏症诱导剂6-羟基多巴胺和trisialoganglioside-GT1b导致的神经元损伤具有保护作用[23,24]。在强迫游泳症和脑外伤小鼠运用用L803-mts处理后有抗抑郁的效果，L803-mts还能改善内神经元β淀粉样肽的负载，在阿尔茨海默氏症小鼠模型中提高其认知能力[12]。与其他的GSK-3抑制剂相比，L803-mts对于神经毒性较低[12,25,26]。

目前L803的临床前期实验结果较好，其后期临床运用也充满希望。用计算机辅助方法，依照其结构特点，结合蛋白突变和功能分析研究，结果表明GSK-3β与底物的结合位点位于Phe67、Gln89、Phe93和Asn 95[19]。Phe67位于P环，属于蛋白激酶家族中最保守的位点，此位点的突变使酶活性完全消失[12]。Gln 89、Phe93和Asn95位于“89-95结合环”，此区域在脊椎动物中也是高度保守[27]，这一结合环和P环一起形成GSK-3底物结合域，Gln89和Asn95位于结合域底部，Phe93则完全暴露在外，位于磷酸基团结合点的对面[27]，因此GSK-3的底物识别特异性取决于易于与广泛底物结合的89-95结合环，以及其对底物预磷酸化的严格选择性。

L803-m ts研究表明，该抑制剂与天然底物比较具有相似点，但与GSK-3β无重叠性相互作用。与其他底物相同的是L803-mts结合于磷酸基团结合域，但不同的是L803-mts并不与Gln89或Asn95结合。L803-mts与89-95环的Phe93紧密结合，也与位于羧基末端的朝向ATP结合域的“疏水补丁”（缬氨酸214，异亮氨酸217和Tyr216）相互作用[27]。目前认为，GSK-3底物和底物竞争性抑制剂与GSK-3的结合通过不同几何形状的底物结合槽相互作用，这种不同的结合模式提高了底物竞争性抑制剂的特异性，例如，在水溶性环境中，疏水性相互作用比极性和电荷的相互作用具有更有高的能量强度，有利于阻止该抑制剂与激酶蛋白疏水片区的解离。

4 底物竞争性抑制剂的改进

L803-mts与GSK-3β结合的立体构象依赖疏水性结合，这一发现提示通过增加多肽的疏水性可能会加强其抑制效果。实验证明，用丙氨酸或脯氨酸代替L803-mts的极性氨基酸谷氨酰胺（第9位）使其抑制效能分别增加4和10倍[27]。为了进一步研究L803的结合模式，我们使用ANCHORSmap方法绘制了GSK-3表面氨基酸侧链的优先结合位点[28]，这种分析表明，带正电荷的结合域极倾向与带负电荷氨基酸残基结合（如GLU），而89-95环附近的结合域则与多种氨基酸结合（譬如精氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酰胺，亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸等）。计算机模拟研究还显示GSK-3β的苯丙氨酸93与L803的其他氨基酸残基结合，实验数据显示，在L803-mts羧基末端加上苯丙氨酸残基（L803F-mts）能使则其抑制效果提高2倍27。

蛋白激酶底物竞争性抑制剂在治疗各种疾病中具有重要的临床应用价值。本文所介绍的抑制剂比传统的ATP竞争性抑制剂相比有许多优点，其中重要的是其高选择性，而且能够达到适度抑制的效果，这些优点对于处理GSK-3活性增加相关疾病时尤为重要，因为这些抑制剂可以适度降低病理组织中GSK-3的过度激活，又可以避免对正常组织中GSK-3功能产生影响，降低毒负作用。目前已经认识到，要设计更有效的底物竞争性抑制剂，不能完全依赖底物间相互作用，还要充分考虑蛋白激酶与底物或与底物竞争性抑制剂结合的空间构象方面的差异。生物学实验和计算机模拟方法相结合，已经用于设计有效的GSK-3抑制剂，这些抑制剂能像底物一样与蛋白激酶相结合，但其与蛋白激酶的结合模式与底物完全不同。

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10.3969/j.issn.1008-4118.2015.01.030

2004-11-23