磷脂酰肌醇蛋白多糖-3在肝癌中的表达及在治疗中的作用研究进展

王慧利，赵金满

中国医科大学附属第一医院消化内科，辽宁 沈阳110001

原发性肝癌(primary hepatic carcinoma，PHC)是原发于肝细胞或肝内胆管细胞的恶性肿瘤，其中肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常见的一种类型。目前，手术切除仍是治疗早期肝癌的最佳选择。然而，即使根治性切除，60% ～70%的患者在术后5 年内仍会发生转移和复发［1-2］，且对放疗、化疗不敏感。现有的治疗方法效果有限，特别是晚期肝癌治疗效果更不理想。

近年来，国内外许多研究［3-4］表明，GPC3 作为细胞表面糖蛋白，在正常肝组织和肝炎患者中不表达而在HCC 中特异性高表达，有望成为肿瘤靶向治疗的候选目标。

1 GPC3 分子组成及其介导的信号转导

GPC3 是硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPGs)家族中的一员，HSPGs 通过磷脂酰基醇锚(GPI)连接于细胞表面。GPC3 位于人染色体(Xq26)上，其最常见的基因(Isoform2，GenBank Accession No.:NP-004475)编码是一个由580 个氨基酸组成的70 kDa 的先导核心蛋白，其能被弗林蛋白酶切割产生40 kDa 的氨基末端亚基(N-)和30 kDa 的羧基末端亚基(C-)两个核心蛋白，其主要作用为羧基末端亚基(C-)近细胞膜的区域含有两条硫酸类肝素(heparan sulfate，HS)聚糖链。通过从不同方面及运用不同技术对GPCs 进行研究发现，GPC3 能参与调节多条信号通路，包括Wnts［5-6］、Hedgehog［7］、β/骨形态生成蛋白(BMP)［8］及成纤维生长因子(FGFs)［9］，介导HCC 的发生和发展。GPC3 还可以与肝素结合型蛋白相结合，如基质成分、细胞黏附分子等，参与调节细胞分化、增殖、黏附和迁移等生理过程。除此之外，Ho 等［10］也表明，GPC3 在CD90+的肝癌干细胞中明显表达，与促进肝癌侵袭、转移密切相关。

2 GPC3 在HCC 检测中的研究

2.1 GPC3 在HCC 组织中的表达 1997 年，Hsu等［11］首次报道GPC3 mRNA 在HCC 中阳性率为74.9%(143/191)和在胃腺癌中呈10%的表达，但在胆管瘤中不表达。Yao 等［12］研究表明，GPC3 在HCC患者组织中阳性率为76.9%(50/65)，在分化较好的HCC 中阳性率可达87. 5% (35/40)。Yu 等［13］运用7D11 单克隆抗体(7D11 mAb)和GPC3 抗原结合的原理检测HCC、肝内胆管细胞管(ICC)、正常人中的GPC3 表达，结果显示GPC3 在HCC 组织中的阳性率为85.0% (34/40)，在ICC 组织和邻近的正常组织中没有检测到GPC3。与以往Zhang 等［14］实验结果基本一致。许多其他器官的肿瘤也可以向肝脏转移。Mounajjed 等［15］研究发现GPC3 在胃肠肿瘤和胰腺肿瘤肝转移的患者中阳性率为14.0%，这表明GPC3 在鉴别HCC 和源于肝外转移的肿瘤中并不具有特异性。Ning 等［16］研究发现GPC3 阳性的HCC 患者5 年生存率为54.5%，明显低于GPC3 阴性的HCC 患者的生存率87.7%，所以，GPC3 高表达可以监测HCC 的不良预后和肝癌转移情况。此外，该研究也提示GPC3 在HCC 中是一个独立的预后预测参数。

2.2 GPC3 在HCC 血清中的表达 血清AFP 表达量在诊断HCC 时并不十分准确，其敏感性为40% ～65%［17］。GPC3 与AFP 相比是一个相对独立的标志物且其敏感性优于AFP。GPC3 在Arg358 和Ser359处被弗林蛋白酶切割成两段，然后释放40 kDa 的含N-端的GPC3 蛋白和与膜结合的30 kDa 的C-端GPC3蛋白［18］，含N 端的40 kDa 的GPC3 蛋白成为可溶性片段(sGPC3)可在HCC 患者血浆中被检测到，可能成为诊断HCC 的新的血清标志物。许多学者［19-20］通过Meta 分析证明，血清GPC3 可作为诊断HCC 的检测指标。Yu 等［21］检测到HCC 患者血清中，GPC3 的敏感性为54.2%、特异性为99.4%，此外，还发现GPC3 在HCC 中的表达量明显高于正常肝组织或者其他肝脏疾病血浆的表达量，即(108. 67 ±230. 04)ng/ml vs(3.99 ±7.68)ng/ml。Lee 等［22］发现，GPC3 在HCC的表达水平明显高于慢性肝脏疾病，即75.8 ng/ml vs 66.4 ng/ml，并且还发现在小肝癌肿瘤中(＜2 cm)GPC3 的敏感性＞60%，而其他肿瘤标志物的敏感性极低(＜10%)。但是，Yang 等［23］通过Meta 分析发现，相比于健康人，HCC 患者血清GPC3 水平明显升高，但是，GPC3 是否能鉴别诊断HCC 和肝硬化仍然不清楚，仍需要进一步研究证明。

Li 等［24］发现，在AFP 阴性HCC 血清中GPC3 的阳性率54.6%。国内学者［25］研究表明，AFP 阴性的HCC 患者中GPC3 的阳性率为75%。因此，血清AFP和GPC3 的联合检测能提高早期诊断HCC 的敏感性和特异性。GPC3 单独或者结合CK19 和AFP 诊断HCC 的敏感性分别是54.2%和90.6%［21］。

3 GPC3 对HCC 的靶向免疫治疗

GPC3 在HCC 中特异性高表达，而在正常肝组织中不表达，许多国内外学者将研究重点放到以GPC3为标志物所介导的免疫治疗，以期发现靶向治疗HCC的新思路［18，26］。

3.1 靶向治疗 靶向治疗分为被动靶向和主动靶向。被动靶向利用肿瘤生物学的特征，纳米载体通过渗透性增强和滞留效应(ERP)积聚在肿瘤组织。虽然被动靶向的方法已经被应用于临床治疗［27-29］，但是其治疗效果仍不十分理想。因为在肿瘤患者中癌细胞无处不在，一些药物并不能有效地扩散到癌组织中或通过癌细胞表面转运蛋白过度表达将药物从细胞排除［30-31］，这种缺乏控制的特点可诱导多药耐药性(MDR)。

主动靶向是化疗药物和特定的与癌症有关的分子偶联在一起的纳米载体。关注靶细胞特异性与癌症有关的分子和细胞的变化，找出某些驱动肿瘤生长的特定分子途径［32］，从而有针对性地治疗肿瘤，能将细胞毒性物质(如抗癌药物DOX)选择性地运送到肿瘤部位，达到定向杀伤肿瘤细胞，同时不伤害正常细胞治疗的目的。

3.2 GPC3 抗体及其对HCC 的免疫疗法 尽管GPC3 的生物学功能仍然不是很清楚，但是其作为一个新兴的靶向治疗HCC 的方法已经开始备受关注。当前，人抗体(HN3)和人源化鼠抗(GC33 及YP7)靶向GPC3 治疗HCC 的方法正在进行不同阶段的的临床试验。

Nakano 等［33］发现，首个针对GPC3 人源化的单克隆抗体hGC33(C 端残基:524-563)已经被用于HCC患者的治疗，hGC33 能诱导抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)反应并且可以抑制HepG2 或Huh7 细胞鼠移植模型中肿瘤生长。hGC33 治疗被组织学证实的晚期HCC 试验已经进入Ⅰ期临床试验阶段，每周GC33 静脉内给药剂量按比例上升(2.5 ～20 mg/kg)。总的来说，GC33 在Ⅰ期临床试验阶段表现了较好的耐受性以及其临床收益达到了预期的评估［34］，因此，目前正在招募晚期HCC 患者进行Ⅱ期临床试验。

有文献［35-37］报道，受HLA-A24(A* 24:02)和H-2Kd 限制的GPC3298-306(EYILSL EEL)以及受HLAA2(A* 02:01)限制的GPC3144-152(FVG EFF TDV)能诱导GPC3 反应性细胞毒T 淋巴细胞(CTLs)并且不发生自身免疫反应。Sawada 等［38］试验证明，对于HLA-A* 02:07 阳性的HCC 患者接受GPC3144-152肽疫苗后出现了较好的临床反应。因此，研究人员正在把GPC3 疫苗用于Ⅱ期临床研究，并计划把GPC3 疫苗与化疗相结合从而达到更好的抗肿瘤效果。Nobuoka等［39］研究表明，GPC3 肽疫苗治疗荷瘤鼠模型最佳治疗方案中不完全弗氏佐剂在疫苗免疫治疗中是不可缺少的，并且肽疫苗免疫有效性有剂量依赖性。

Phung 等［40］通过GPC3 肽(氨基酸残基:510-560)免疫产生一种新的鼠抗体(YP7)，通过流式细胞术高通量细胞结合筛选此种抗体。发现YP7 较1G12 有较高的灵敏性并且YP7 的表位和GC33 表位重叠。YP7又具有体内肿瘤抑制活性，在抗体疗法中有巨大潜力。未来可能在治疗肝癌中起到重要作用。

尽管人源化的鼠单克隆抗体已经应用于临床试验，但人类产生的抗鼠抗体和其他的副作用仍然需要解决。Feng 等［41］研究出一种人蛋白重链可变区的单域抗体HN3。运用噬菌体载带技术靶向到GPC3，并且以高亲和力结合GPC3 核心蛋白中独特(包括N-结构和C-结构)的构象表位。HN3 能直接抑制HCC 细胞增殖并且能使细胞周期停滞在G1期，从而抑制肿瘤生长。HN3 之所以能直接抑制HCC 细胞增殖，主要是通过作用于下游的信号通路Yap 和细胞周期蛋白D1。在Hep3B 细胞，敲除Yap 基因同时过表达活性Yap 突变体-YapS127A［42］。敲除Yap 后减少了细胞周期蛋白D1 的表达和细胞增殖，YapS127A 的过表达能完全消除HN3 活性，增加细胞周期D1 的表达和细胞增殖。

Zitterman 等［43］研究表明，HCC 细胞接种慢病毒后，GPC3 不能通过GPI 锚定于细胞表面，因此被分泌到细胞外环境中形成sGPC3，导致HCC 细胞增殖速度下降。也可以使Wnts 从细胞表面移除减少和配体Fizzled 的结合，而减弱Wnts 通路的作用，减少HCC 的发生和发展。此外，Feng 等［44］构建了一个sGPC3 的重组体(GPC3 △GPI，氨基酸残基Q25-H559)，此sGPC3 蛋白以负性调节形式抑制体外HCC 的增长。重组sGPC3 是否能抑制HCC 细胞的体内生长而成为治疗HCC 的新方法仍需进一步研究。

4 问题与展望

虽然GPC3 免疫治疗靶向性好，但仍有一定的局限性，如患者自身体质问题等。因此，可以把免疫治疗和化疗结合起来。目前，我们正在进行一项研究，使纳米粒子偶联GPC3 抗体及化疗药物。利用纳米的缓释及抗体靶向作用，使化疗药物在产生高效抗肿瘤的同时也能减少对其他正常器官的毒副作用。其在体外已经表现出较好的效果，在体内的效果仍待研究。

综上所述，利用生物免疫偶联化疗药物的主动靶向疗法来弥补单纯化疗的某些不足及减少其严重的毒副反应，是今后进行肿瘤治疗的发展趋势。

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