激活素A 对小鼠中性粒细胞活性的调控作用①

齐 妍 崔雪玲 闫 青 吴 倩 柳忠辉 葛敬岩 (吉林大学基础医学院免疫系，长春 130021)

中性粒细胞是血液循环中数量最多的白细胞，是机体防御细菌和真菌等病原体重要的固有免疫细胞，具有吞噬、迁移及呼吸爆发等细胞功能［1］。活化的中性粒细胞可以通过呼吸爆发产生大量超氧阴离子及活性氧(Reactive oxygen species，ROS)造成微生物的损伤和死亡［2，3］。中性粒细胞还参与多种炎症相关性疾病的发生发展，近几年通过调控中性粒细胞来减少炎症反应对机体损伤的相关研究逐渐增多。激活素A(Activin A)属于转化生长因子β(Transforming growth factor β，TGF-β)超家族的多功能免疫调节因子，激活素A 异常表达与炎性疾病密切相关［4］，已知多种免疫细胞可产生激活素A，包括单核巨噬细胞、肥大细胞及Th2 细胞等［5-7］。最近研究表明中性粒细胞也是激活素A 的主要来源细胞之一，炎症活化中性粒细胞及巨噬细胞均可快速释放大量的激活素A［8］，激活素A 又以自分泌/旁分泌形式调控巨噬细胞功能，但激活素A 能否以自分泌/旁分泌形式调控中性粒细胞活性，以及调控中性粒细胞的信号传导机制，仍无确切报道。因此，本研究拟通过检测中性粒细胞激活素受体表达(ActR)以及中性粒细胞活性，阐述激活素A 调控中性粒细胞的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 C57BL/6 小鼠，雄性，8～10 周，由吉林大学动物中心提供。

1.2 主要试剂 激活素A 购自R＆D 公司;Percoll购自GE Healthcare 公司;PE 标记Anti-Gr-1 购自ebioscience 公司;APC 标记Anti-ActRⅡA 购自R＆D公司;超氧化物检测试剂盒及活性氧检测试剂盒购自碧云天公司。

1.3 分离中性粒细胞 每只小鼠腹腔注射9%酪蛋白1 ml，第一次注射后24 h 重复注射一次同等剂量的酪蛋白，第二次注射后3 h 收集小鼠腹腔积液细胞。将收集好的细胞用冷PBS 洗涤3 次后，用含10%小牛血清的RPMI1640 培养基重悬，转移至50 ml 培养瓶中，37℃，5%CO2饱和湿度的培养箱内培养2 h 后，收集悬浮细胞。将收集好的细胞(5 ×107ml-1)与100% Percoll 以1∶9的比例在超速离心管中混合，将混合液4℃，190 000 r/min 离心65 min，弃掉含有巨噬细胞和淋巴细胞的第一层液体，收集第二层液体中的细胞。将收集好的细胞用迪夫快速染色试剂染色观察，并用流式细胞术检测Gr-1+细胞，此方法分离的中性粒细胞纯度大于90%。

1.4 免疫荧光细胞化学染色检测ActRⅡA 及Gr-1表达 使用免疫荧光细胞化学染色检测中性粒细胞激活素ⅡA 型受体(ActRⅡA)表达。将分离后的中性粒细胞用冷FACS 液洗涤细胞2 次，加入兔抗ActRⅡA(1∶500)，4℃孵育过夜，冷FACS 液洗涤细胞2 次，加入FITC 标记Anti-Rabbit-IgG、PE 标记Anti-Mouse-Gr-1 及DAPI，4℃避光孵育30 min，FACS 液洗涤2 次，荧光倒置显微镜下观察拍照。同型对照组加入兔IgG 代替兔抗ActRⅡA，PE 标记IgG 代替PE 标记Anti-Mouse-Gr-1 进行孵育。

1.5 流式细胞术检测Gr-1 及ActRⅡA 表达 使用流式细胞术检测Gr-1 及ActRⅡA 表达。将分离后的中性粒细胞用冷FACS 液洗涤细胞2 次，加入100 μl 冷的FACS 液重悬，分别加入APC 标记Anti-Mouse-ActRⅡA 及PE 标记Anti-Mouse-Gr-1，4℃避光孵育30 min，FACS 液洗涤2 次，300 μl FACS 液重悬细胞，流式细胞仪进行检测，同型对照组加入APC 标记Mouse-IgG 及PE 标记Mouse-IgG。

1.6 Western blot 检测激活素A 刺激后Smad3 表达 将分离好的中性粒细胞(3 ×106)加入激活素A(0～10 ng/ml)，37℃，5% CO2饱和湿度的培养箱内孵育30 min。收集细胞，分别加入蛋白裂解液［1% Triton X-100，500 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L PMSF，4 μg/ml leupeptin，1 μg/ml aprotinin］，充分裂解后，离心取上清。蛋白通过SDS-PAGE 分离后，转印至聚偏氟乙烯膜(PVDF)上，分别加入兔抗ActR ⅡA 抗体(1 ∶1 000)，兔抗Smad3 抗体(1 ∶500)，兔抗磷酸化Smad3(p-Smad3)抗体(1∶500)及兔抗GAPDH 抗体(1∶1 000)孵育，洗涤3 次后，加入辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 IgG 孵育，最后加入ECL 试剂(ECLPlus;Amersham Pharmacia Biotech)，通过化学发光成像检测目的蛋白。

1.7 检测激活素A 刺激后中性粒细胞内ROS 水平 利用荧光探针DCFH-DA 进行细胞内活性氧(Reactive oxygen species，ROS)检测，DCFH-DA 本身无荧光，可被细胞内酯酶水解生成DCFH，ROS 可将无荧光的DCFH 氧化生成有荧光的DCF，最后通过测定荧光强度从而检测细胞内ROS 水平。将分离好的中性粒细胞(1 ×106)加入激活素A(0～10 ng/ml)，37℃，5% CO2饱和湿度的培养箱内培养12 h。去除细胞培养液，加入DCFH-DA，37℃细胞培养箱内孵育20 min，用无血清细胞培养液洗涤细胞3 次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。使用荧光酶标仪检测荧光强度，激发波长为488 nm，发射波长为525 nm。

1.8 检测激活素A 刺激后O2-的产生 O2-的检测使用超氧化物检测试剂盒(分解水溶性四唑盐，WST-1)。将分离好的中性粒细胞(1 ×106)加激活素A(0～10 ng/ml)，37℃，5% CO2饱和湿度培养箱内培养12 h。去除细胞培养液，加入含有WST-1 的反应液，37℃避光孵育5 min，使用酶标仪在450 nm测定吸光度值A。

1.9 检测激活素A 刺激后NO 分泌水平 将分离好的中性粒细胞(1 ×106)加入激活素A(0～10 ng/ml)，37℃，5% CO2饱和湿度的培养箱内培养12 h。收集上清，Griess 法检测NO，将上清液与Griess 试剂［0.1% N-(1-萘基)乙二胺二盐酸盐，1%对氨基苯磺酸和2.5%磷酸］等体积混合，室温孵育5 min。使用酶标仪在540 nm 测定吸光度值A。双蒸水稀释的亚硝酸盐作为标准品，浓度从1～100 mmol/L。

1.10 激活素A 刺激后中性粒细胞吞噬活性 将分离好的中性粒细胞(3 ×106)加入激活素A(0～10 ng/ml)，37℃，5%CO2饱和湿度的培养箱内培养12 h。加红色荧光微球(Microspheres，Red Fluoresent)，37℃孵育1 h 后洗去未被吞噬的红色荧光微球，收集细胞，流式细胞术检测吞噬百分率。

2 结果

2.1 分离小鼠腹腔中性粒细胞 迪夫快速染色结果显示用此方法得到的中性粒细胞纯度＞90%(图1A)，对分离后的细胞用PE 标记抗鼠Gr-1 与FITC标记抗鼠CD3 抗体双染，结果显示Gr-1+细胞占细胞总数＞99%(图1B)。

2.2 中性粒细胞表达ActRⅡA 免疫荧光染色结果显示中性粒细胞可以同时表达Gr-1 与ActRⅡA(图2A)，流式细胞术检测结果显示中性粒细胞中Gr-1 与ActRⅡA 双阳性细胞为41.14%(图2B)。

图1 小鼠腹腔中性粒细胞的分离Fig.1 Isolation of peritoneal neutrophils in mouse

图2 ActRⅡA 在中性粒细胞的表达Fig.2 Expression of ActRⅡA on mouse neutrophils

图3 激活素A 对中性粒细胞激活素信号蛋白Smad3 表达的影响Fig.3 Effects of activin A on expression of Smad3 in mouse neutrophils

2.3 激活素A 对中性粒细胞激活素信号蛋白Smad3 表达的影响 如图3 所示，激活素A 刺激后，中性粒细胞p-Smad3 表达上调，Smad3 蛋白表达有所下降，该结果进一步表明，激活素A 可以作用于中性粒细胞并导致激活素信号传导通路的活化。

图4 激活素A 对中性粒细胞呼吸爆发的影响Fig.4 Effects of activin A on respiratory burst

图5 激活素A 对中性粒细胞NO 分泌及吞噬作用的影响Fig.5 Up-regulation of activin A on production of NO and phagocytosis of mouse neutrophils

2.4 激活素A 对中性粒细胞呼吸爆发的影响 结果显示，激活素A 可以增加中性粒细胞内ROS(图4A)及细胞外O2-的产生(图4B)，该结果提示激活素A 可能通过激活中性粒细胞，增加中性粒细胞的耗氧量，产生呼吸爆发，提供中性粒细胞抗感染作用。

2.5 激活素A 促进中性粒细胞NO 分泌及吞噬能力 如图5 所示，不同浓度的激活素A 均可以促进中性粒细胞产生NO，流式细胞术检测结果显示激活素A 可以明显促进中性粒细胞对红色荧光微球的吞噬。

3 讨论

激活素A 是重要的免疫调节因子，可由多种免疫细胞产生，并对多种免疫细胞功能具有调节作用，最近有研究显示TNF-α 可以通过p38 MAPK 信号通路刺激中性粒细胞分泌大量激活素A［8］，然而，这些由中性粒细胞分泌的激活素A 是否可以作用于中性粒细胞目前尚不明确。激活素受体属于丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)激酶型受体，分为激活素Ⅰ型受体(AcRⅠ)及激活素Ⅱ型受体(ActRⅡ)。激活素首先与ActRⅡ结合形成复合体，导致ActRⅡ变构，激活ActRⅠ，进而引发细胞内信号蛋白Smad 家族的级联反应，将信号传导入细胞核内［9］。Smad 蛋白家族中的Smad2、3 可以介导TGF-β 和激活素的信号传递，磷酸化Smad3 对激活素信号传导具有极其重要的作用［10，11］。本研究通过免疫荧光细胞化学染色以及流式细胞术检测结果显示，中性粒细胞标志物Gr-1 和ActRⅡA 可以共表达于中性粒细胞表面，而且激活素A 刺激中性粒细胞后可以上调激活素信号传导蛋白Smad3 磷酸化，上述资料充分证明，中性粒细胞不仅可以产生激活素A，同时也是激活素A 作用的靶细胞，激活素A 可能通过自分泌/旁分泌形式调控中性粒细胞活性。

激活素A 在一些主要由中性粒细胞参与的疾病中表达升高［12，13］，然而激活素A 是否可以调节中性粒细胞活性，目前仍无确切证据。我们的研究结果表明，激活素A 对中性粒细胞多种功能均有调节作用。呼吸爆发是中性粒细胞发挥其功能的重要机制，激活素A 可以增加中性粒细胞内ROS 及细胞外O2-的产生，使中性粒细胞产生呼吸爆发。此外，激活素A 还具有刺激中性粒细胞分泌NO，增强中性粒细胞的吞噬作用。

综上所述，本研究证明激活素A 可以直接作用于中性粒细胞，并调节中性粒细胞多种功能，在中性粒细胞介导的炎症应答中可能具有重要意义。

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