C-反应蛋白上转发光免疫层析试纸条的研制

周明泽

(北京热景生物技术有限公司，北京100076)

上转磷光技术(UPT)是近年来发展起来的一种具有高灵敏度，基于上转磷光体UCP的新型生物检测技术［1］。其中，上转磷光颗粒是纳米级的晶体颗粒，它由包埋于氧化硫等惰性材料中的稀土镧系元素组成。其特性可由红外线激发，而发射红、蓝、绿等不同波长的可见光［2］。磷光信号可由改进的落射显微镜进行观察，并可用计算机系统进行检测和分析，达到定性、定量检测生物活性分子的目的［3］。

UCP具有高度的灵敏性、稳定性、简易性、灵活性、安全性等独特光学特性，使其作为新型标记物在生物检测领域将发挥巨大的潜能。迄今为止，上转磷光技术已被应用于免疫标记分析、免疫层析分析等多种标记检测技术中。近年来发现C-反应蛋白浓度甚至在正常范围内的轻度升高都与心血管疾病发生的危险性增加有关，可以推测心肌梗死事件发生的可能性。超敏C-反应蛋白是心脑血管疾病中的一项独立风险预测指标，可以敏感地预测糖尿病合并心脑血管事件的危险发生率［4］。所以CRP的定量测定至关重要。

CRP是一种能与肺炎链球菌C多糖体反应的急性时相蛋白，在组织损伤、感染等刺激下，被激活的单核细胞释放白细胞介素1(IL．1)，刺激肝细胞加速合成CRP，对炎症感染的发生发展存在很大的相关［5－6］。笔者是在双抗体夹心免疫分析的基础上建立起来的检测方法，具有反应时间短，灵敏度高，特异性、准确性、稳定性好，无环境污染和放射危害的特点［7］。

1 材料与方法

1．1 抗体配对筛选 抗体配对筛选采用的是同时对几组抗体标记及包被，最后相互配对来测定CRP校准品，根据试验结果来选择标记及包被抗体。主要利用克隆号为3B11、3C8等抗体来标记及包被，包被量按2．0 mg/ml，标记比例按mucp∶m抗体=20∶1来测定CRP校准品，最终根据测定的灵敏度、测定结果梯度及反应强度等来选择抗体配对。

表1 抗体配对组合

1．2 反应条件的选择 由于CRP测定过程中反应时间对测定结果有影响，为了满足临床快速诊断的要求，同时也要保证试剂测定的准确性及符合率，故在相同的试纸条测定相同样本在不同时间的变化，该试验主要是加样孔中分别加入稀释后的样本100μl，室温反应不同时间后，测量各试纸条的T/C值来平行对比。

2 结果与分析

2．1 抗体配对筛选 由图1可知，经过2株抗体3B11及3C8的相互配对，结果表明:①3C8标记和3B11包被测定结果灵敏度好，线性相关也很好，在抗体配对中，该标记、包被的配对情况均符合要求;②3B11标记和3C8包被测定结果灵敏度不是特别好，线性相关也不是特别好，但抗体配对仍有反应，若3C8标记与3B11配对仍无法调节到最优，可以考虑使用此配对方案来调整;③3C8标记及3C8包被配对不成功，反应均没有一定的梯度，高浓度仍与阴性相同;④3B11标记及3B11包被配对并不是最好，线性相关并不好，目前暂且不使用此配对。综上分析，目前CRP测定使用3C8标记和3B11包被，可以实现一个较优组合。

2．2 反应条件的选择 由图2可知，反应5 min时T/C值较低，线性也不够理想，反应10～20 min时T/C值基本稳定，线性、灵敏度也较满意。考虑到免疫层析反应的特点，一般15 min才能完成层析过程，所以选择15 min作为反应时间。

3 讨论

上转换发光材料的出现为免疫层析技术的发展提供了新的空间。自然界中所有物质的发光过程均需遵循Stokes规则，即发射光的波长长于激发光的波长［8］。

上述特点使得UCP作为生物标记物有着极为广泛的应用前景。因而在以抗原抗体为代表(还可包括核苷酸等)的UCP标记技术平台的基础上，使其与免疫层析技术相结合，再利用微型化的光电子材料可以开发出一种灵敏、快速、操控简易的免疫诊断分析仪［9］。

目前美国国防部研制的UPT仪器用于生物防恐检测鼠疫、定量检测炭疽芽孢，美国Orasure公司研制的UPT仪器用于检测艾滋病病毒抗体、毒品含量定量检测等，我国国内科研单位如军事医学科学院流行病研究所杨瑞馥课题组研究该领域已经将近10年，已经研制成功鼠疫、O157细菌、炭疽芽孢、表面抗体定量检测等免疫层析检测试剂，相关文献发表20余篇，SCI文献发表10 余篇［10］。

4 结论

该研究主要在上转发光技术平台上，通过抗体筛选、反应条件的选择来确立C-反应蛋白测定条件，建立起包被浓度2 mg/ml和反应时间15 min时，与人血清白蛋白、胆红素等结构类似物无交叉反应，且具有反应时间短，灵敏度高，特异性、准确性、稳定性好，无环境污染和放射危害的试剂。同时通过抗体配对筛选，3C8标记和3B11包被可以实现一个较优组合，2 mg/ml的包被浓度及反应时间在15 min时，能保证T/C值，线性和灵敏度较好。

［1］陶义训．免疫测定进展［J］．上海免疫学杂志，1999(2):2 －5．

［2］ZLEMANH，BONNET S，BURTON J．Detection of cell and tissue surface antigens using up-converting phosphors:A new reporter technology［J］．Analytical biochemistry，1999，267:30 －36．

［3］INEDIBLE R S，VAIL T L，FEINT H．Multi photon up-converting phosphors for use in rapid immunoassays:In in-vitro diagnostic instrumentation［J］．Proceedings of SPIED，2000，3913:193 －203．

［4］ZHAOY，ZHOUL，HUANGH，et al．UPT-based biosensor and its application［J］．Proc of SPIE，2005，5630:833 －843．

［5］GUTIERREZ SL，WELTY T E．Point-of-care testing:An introduction［J］．Ann Pharmacotherapy，2004，38:119 －125．

［6］BLACK S，KUSHNER I，SAMOS D．C-reactive protein［J］．J Bill Cham，2004，279:487 －490．

［7］HIRSCHFIELD G M，PEPYS M B．C-reactive protein and cardiovascular disease:New insights from an old molecule［J］．QJM，2003，96:793 －807．

［8］卢健，周蕾，赵永凯，等．上转换发光免疫试纸条扫描检测系统研究［J］．光子学报，2006，35(4):555 －560．

［9］王静，周蕾，胡孔新，等．2种免疫层析技术用于4种传染病及其病原体检测的研究［J］．中国国境卫生检疫杂志，2006(29):27－34．

［10］赵永凯，周蕾，黄惠杰，等．基于上转换发光技术生物传感器及其应用［J］．光学学报，2005，25(6):841 －847．