细胞分裂相关基因Spc25的分子进化研究

邢雪琨

(新乡医学院生命科学技术学院，河南新乡453003)

染色体不稳定性与肿瘤形成有密切的关系［1－2］。多种因素能导致染色体的不稳定，如染色体分离、细胞周期检验点、DNA损伤等。在有丝分裂的染色体分离过程中，动粒与微管的结合起着重要的调节作用。众多蛋白参与该活动，Ndc80复合体就是其中关键的一员。Ndc80复合体由Hec1、Nuf2、Spc24 和 Spc25 4 种蛋白组成［3－5］。Spc25 作为 Ndc80复合体的组成部分，可能是动粒－微管形成机制的一部分，涉及有丝分裂和肿瘤发生的重要环节。虽然学者们针对Ndc80开展了大量研究，然而对于Ndc80的作用机制仍不清楚，对Spc25更是知之甚少。

笔者采用生物信息学手段分析在不同生物中Spc25基因的长度多态性、终止密码子多态性、外显子个数变化、氨基酸序列多样性和该基因编码的保守区，并在此基础上建立不同生物Spc25基因上的进化图谱，初步了解不同生物Spc25基因的演化关系，为研究该基因参与染色体分离和肿瘤发生的作用机理提供资料。

1 材料与方法

1．1 试验材料 在NCBI中输入“Spc25”搜索得到多种生物的基因序列，挑选分别代表真菌、无脊椎动物昆虫、脊椎动物鱼、两栖、爬行、鸟和哺乳动物7类生物的粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、果蝇(Drosophila melanogaster)、斑马鱼(Danio rerio)、半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)、非洲爪蟾(Xenopus laevis)、海龟(Chelonia mydas)、缅甸蟒蛇(Python bivittatus)、原鸽(Columba livia)、原鸡(Gallus gallus)、人(Homo sapiens)、小鼠(Mus museulus)、大鼠(Rattus norvegieus)、牛(Bos taurus)、恒河猴(Macaca mulatta)、马(Equus caballus)16种不同生物进行Spc25基因分析。

1．2 试验方法

1．2．1 序列长度多态性分析。分析Spc25基因及其ORF序列，以得到不同生物Spc25基因长度的变异及序列特征。

1．2．2 终止密码子变异分析。统计Spc25基因的终止密码子变异情况，为研究Spc25基因转录调控机制提供资料。

1．2．3 外显子个数分析。统计Spc25基因的外显子个数，分析该基因转录的调控情况。

1．2．4 氨基酸序列的同源性比对。用DNAMAN软件中的Alignment程序对Spc25基因编码的氨基酸序列进行同源性比对，并分析其保守区域，构建系统进化树。

2 结果与分析

2．1 序列长度多态性 核酸序列分析表明，Spc25基因序列变化较大，从酿酒酵母的666 bp到粟酒裂殖酵母的4 156 bp，相差3 490 bp。但开放阅读框(open reading frame，ORF)长度都在666～717 bp，其中酿酒酵母666 bp较短，粟酒裂殖酵母717 bp较长(表1)。说明在进化过程中，尽管不同生物所处环境不同，基因调控有较大差异，但编码序列比较保守，从真菌到脊椎动物变化都较小。

2．2 终止密码子变异分析 在所研究的l6种生物中，有13种Spc25基因都是以TAA作为终止密码子，有3种(果蝇、小鼠和大鼠)以TGA作为终止密码子，没有以TAG作为终止密码子(表1)。说明生物有以TAA作为终止密码子的倾向。

2．3 外显子个数分析 真菌和无脊椎动物Spc25基因有1～3个外显子，脊椎动物中鱼、两栖、爬行和鸟类的外显子个数在6～8个，哺乳动物除恒河猴9个外显子外，都有8个外显子(表1)，说明在进化过程中，Spc25基因外显子有从少到多的过程，最后趋于有8个外显子。

2．4 氨基酸序列的同源性比较 用DNAMAN中的Alignment程序对16种生物Spc25基因编码的氨基酸序列进行比较，发现脊椎动物间Spc25同源性在9．5% ～100．0%，特别是哺乳动物间同源性较高，人和恒河猴的同源性达100%。但真菌、无脊椎动物与脊椎动物差别较大，它们的相似性仅在6．8%～20．5%(表2)。所有生物最后的130个氨基酸是Spc25最为 保守的区域(图1)，可能与其功能有重要关系。

表1 Spc25基因序列多态性

表2 Spc25氨基酸序列的同源性比较%

2．5 Spc25基因的分子进化树 用DNAMAN中的Alignment程序绘制上述16种生物Spc25基因的分子进化树(图2)，除真菌中的酿酒酵母与无脊椎动物的果蝇聚在一起外，其他生物都是同一类的生物聚在一起，而且亲缘关系与物种进化顺序一致。

3 讨论

Spc25是参与动粒-微管相互作用的Ndc80复合体的成分之一。生物信息学分析表明，Spc25基因的开放阅读框从真菌到脊椎动物变化都较小，几乎都在666～717，编码序列比较保守。大部分生物有以TAA作为终止密码子的倾向，没有以TAG作为终止密码子的。Spc25基因外显子有从少到多的过程，最后趋于有8个外显子。哺乳动物间氨基酸序列高度同源，最后的130个氨基酸是Spc25最为保守的区域。以上研究结果提示Spc25是一个较为保守的基因，在动粒－微管的连接中发挥了重要作用，它的稳定表达对染色体的稳定性和抑制肿瘤发生起着关键作用。

［1］VENKITARAMANA R．Chromosome stability，DNA recombination and the BRCA2 tumour suppressor［J］．Curr Opin Cell Biol，2001，13(3):338 －343．

［2］VENKITARAMAN A R．Tumour suppressor mechanisms in the control of chromosome stability:Insights from BRCA2［J］．Mol Cells，2014，37(2):95－99．

［3］UMBREIT N T，GESTAUT D R，TIEN J F，et al．The Ndc80 kinetochore complex directly modulates microtubule dynamics［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2012，109(40):16113 －16118．

［4］CIFERRI C，PASQUALATOS，SCREPANTIE，et al．Implications for kinetochore-microtubule attachment from the structure of an engineered Ndc80 complex［J］．Cell，2008，133(3):427 －439．

［5］ALUSHINGM，MUSINIPALLY V，MATSON D，et al．Multimodal microtubule binding by the Ndc80 kinetochore complex［J］．Nat Struct Mol Biol，2012，19(11):1161 －1167．