急性持续热应激对成年兔血液部分生理生化指标的影响

黄光远，赵 川，杨晓炼，赵 杰，潘芳燕，阳丹丹，黄庆洲

(西南大学荣昌校区动物医学系，重庆402460)

热应激是动物在超出适宜温度范围的高温环境中饲养时对热应激源所作出的非特异性生理反应［1－2］。过度的热应激可使动物的采食量、饲料报酬、抗病力和繁殖率等生产指标显著降低，甚至导致动物大量死亡，给养殖生产带来极大危害［3］。在我国大部分地区，特别是西南地区，由于夏季高温、高湿度持续时间长，环境温度持续在30℃左右的时间长达3个月之久，热应激成为危害该地区规模化养殖的重要环境因素之一［4］。对动物热应激机制及如何降低其对养殖生产的影响已成为学术界重要的研究课题。多数学者认为，热应激与机体交感－肾上腺髓质系统及下丘脑－腺垂体－肾上腺皮质机亢进，肾上腺素、糖皮质激素等分泌增多，引起一系列代谢紊乱，免疫及生殖机能、采食量降低等相关，对动物生产性能带来极大的负面影响［3］。关于急性持续热应激对动物血液生理生化指标的影响报道较少。笔者以成年健康肉兔为试验动物，观察了人工35℃、72 h持续热应激对成年动物血液部分生理生化指标的影响，以期为热应激机制研究提供基础试验数据。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 主要仪器。紫外分光光度计(上海菁华科技有限公司，E-14-08-007)、电解质分析仪(深圳市航创医疗设备有限公司，HC-9886)、自动血细胞分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)、SSW型电热恒温水槽(上海博讯实业有限公司)、低温离心机(上海安亭科学仪器厂制造)、－40℃低温冰箱(海尔)、格力空调(珠海格力电器有限公司)、肝素锂一次性真空采血管(江苏康健医疗用品有限公司)。

1．1．2 生化指标测试药盒。谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)测试盒(批号分别为20140912、20140905)，包括谷丙转氨酶基质液、谷草转氨酶基质液、2，4-二硝基苯肼液、丙酮酸钠标准液等;总胆固醇(TC)测试盒(批号为F0021-1)，主要试剂有胆固醇激酶、胆固醇氧化酶、过氧化物酶等;葡萄糖(Glu)测试盒(批号为F006)，主要试剂有对羟基苯甲酸盐、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶 、4-氨基安替比林等;甘油三酯(TG)测试盒(批号为F001-1)，主要试剂有脂肪酶、甘油磷酸氧化酶、甘油激酶、ATP等;蛋白定量测试盒(批号为A045-2):考马斯亮蓝贮备液、蛋白标准品等。试验盒均由南京建成生物工程研究所生产。

1．1．3 试验动物。健康新西兰肉兔16只，雄性，体重2．0～2．5 kg/只，由西南大学荣昌校区动物科提供。

1．1．4 动物饲料。精深兔料860ZQA兔配合饲料(成都营大农牧发展有限公司生产，批号20140624)。其中，粗蛋白≥16．0%、粗纤维 10．0% ～12．0%、粗灰分≤10．0%、粗脂肪≥2．0%、钙0．5 ～1．0%、钙磷比(%)2∶1、氯化钠0．5%、水分≤12．5%、赖氨酸≥0．7%;饲料中主要微量元素含量为:Cu≤40 mg/kg、Fe≥80 mg/kg、Zn≥60 mg/kg;VA≥9 000 IU/kg、VD≥900 IU/kg、VE≥40 IU/kg。

1．2 方法

1．2．1 动物分组。试验时间安排在2014年7月7日至7月20日进行，试验地点在西南大学荣昌校区动物房。将16只健康兔移入普通立体兔笼饲养，每笼2只，自由采食和饮水，试验期间自然环境温度27～32℃，常规饲养7 d，观察采食和饮水无异常情况后，转入正式试验。将动物随机分为热应激组(饲舍温度控制为(35±1)℃)和适温组(饲养环境温度控制在(24±1)℃)，每组8只，每组单独房间饲养。

1．2．2 饲舍温度控制方法。热应激组:用200 W红外线保温灯泡加热，于试验当天8:00开始逐渐升温，至当天12:00饲舍温度达到(35±1)℃(空气湿度变化范围为65% ～75%)，高温持续时间72 h;适温组:用空调降温，于试验当天8:00开始逐渐降温，至当天12:00饲舍温度达到(24±1)℃(空气湿度变化范围为65% ～75%)，适温持续时间72 h。

1．2．3 饲养方式及热应激处理时间。肉兔自由采食和饮水，每天8:00和18:00各饲喂1次，(35±1)℃热应激处理持续时间72 h。

1．2．4 血浆收集及保存。正式试验从早上8:00开始，每隔24 h后(即第2天早上8:00)，用肝素锂真空采血管于兔的后肢外侧静脉采抗凝血5 ml，取1 ml抗凝血进行血细胞数量测定，其他血液4℃、3 000 r/min离心5 min，收集血浆，分装于1．5 ml指形管(0．5 ml/管)，－40 ℃保存，1 月内待测。

1．2．5 血细胞数量的测定。采用自动血细胞分析仪进行血细胞数量的测定。

1．2．6 血浆电解质含量的测定。采用临床电解质分析仪测定血浆电解质含量。将低温保存的血浆自然解冻，先用A标准液基点定标，吸样口吸取血浆125 μl，测定Na+、K+、Cl－和Ca2+的含量。

1．2．7 血浆生化指标的测定。血浆GOT和GPT活性的测定采用赖氏法，以卡门氏单位作为酶的活性单位。卡门氏单位的定义:1 ml血清，反应总容量3 ml，340 nm波长，1 cm光径，25℃、1 min内所生成的丙酮酸，使NADH氧化成NAD而引起吸光度每下降0．001为1个卡门氏单位;血糖浓度采用葡萄糖氧化酶－过氧化物酶法测定，甘油三酯、血浆胆固醇含量的测定均采用酶偶联比色法，血浆总蛋白温的测定采用双缩脲法。操作步骤按照试剂盒说明书的方法进行。

1．2．8 数据统计与分析。试验数据使用SPSS15．0统计软件进行显著性检验，结果以平均值±标准差(¯x±s)表示。

2 结果与分析

2．1 急性持续热应激兔血细胞数量的变化 由表1可知，急性持续热应激24 h后，热应激组白细胞数、中性粒细胞数、血小板数显著高于或极显著高于适温组(P＜0．05或P ＜0．01)，淋巴细胞比率显著低于适温组(P ＜0．05);急性持续热应激48 h后，白细胞数、血小板数显著或极显著高于适温组(P＜0．05或 P＜0．01);急性持续热应激72 h后，血小板数、中性粒细胞比率显著高于或极显著高于适温组(P＜0．05或P＜0．01)，而淋巴细胞数显著低于适温组(P＜0．05);其他指标同一时间点各组间差异均不显著(P＞0．05)。

表1 急性持续热应激兔血细胞数量的变化¯x±s

2．2 急性持续热应激兔血浆部分生化指标的变化 由表2可知，急性热应激处理24、48、72 h后，热应激组血糖含量与适温组差异均不显著(P＞0．05);血浆总蛋白热应激24 h后，热应激组显著降低(P＜0．05)，热应激48、72 h后组间差异不显著(P＞0．05);血浆甘油三酯和胆固醇的含量变化基本一致，热应激24、48、72 h后热应激组均显著或极显著高于适温组(P＜0．05或P＜0．01);谷丙转氨酶(GPT)的活性热应激24和48 h后显著或极显著低于适温组(P＜0．05或P＜0．01)，热应激72 h后2组间差异不显著(P ＞0．05);谷草转氨酶(GOT)活性热应激24、48、72 h后显著或极显著高于适温组(P ＜0．05或 P ＜0．01)。

2．3 急性持续热应激兔血浆电解质含量的变化 由表3可知，热应激组72 h后Na+含量极显著低于适温组(P＜0．01)，Cl－含量热应激24、48 h 后高于适温组(P ＜0．05)，血浆游离钙(iCa)含量热应激组48 h后显著低于适温组(P＜0．05);血浆 Na+、K+、Cl－、iCa2+含量其他时间点 2 组间差异均不显著(P ＞0．05)。

3 讨论

3．1 急性持续热应激对兔血细胞数量的影响 研究表明，在35℃持续热应激72 h内，白细胞数和中性粒细胞数呈先升高，然后恢复正常，淋巴细胞在前中期变化不大，72 h后呈降低趋势，而整个试验期间血小板数均呈极显著升高的趋势;细胞比率变化方面，淋巴细胞比率早期降低，中后期恢复稳定，中性粒细胞比率前中期基本稳定，后期显著升高。白细胞数、中性粒细胞和淋巴细胞作为机体防御免疫细胞，是机体非特异和特异性免疫的关键细胞，急性持续热应激72 h内引起其数量的变化趋势，一定程度上说明急性热应激早期机体非特异免疫呈增强趋势。但是随着热应激时间的持续，特异免疫机能可能受到一定程度的抑制，其原因可能与随着热应激的延长，肾上腺皮质机能亢进、糖皮质激素分泌增加和抑制淋巴细胞的生成有关［5－6］。成年兔急性持续热应激72 h内，血小板数量显著升高，可能与兔处于急性高温环境导致机体脱水及血液循环功能增强有关，但这种变化在热应激中的生物学意义有待深入研究。该试验中兔血细胞数量的变化趋势与其他报道［7－8］存在一定差异，可能与热应激的方式及持续时间长短有关。

表2 急性持续热应激兔血浆生化指标的变化

表3 急性持续热应激兔血浆电解质含量的变化

3．2 急性持续热应激对兔血液生化指标的影响 研究表明，在35℃持续急性热应激72 h内，兔血糖水平呈降低的趋势，血浆总蛋白含量早期显著降低，中后期趋于稳定，血浆甘油三酯、胆固醇含量及GPT活性显持续升高，而GOT活性呈降低趋势。动物处于急性持续热应激状态时，机体采食量降低，耗氧增加，分解代谢加快，能量释放增加，导致血糖及血浆蛋白降低，说明在饮水或饲料中适当添加葡萄糖及蛋白含量对于提高动物抗热应激能力是必须的。甘油三酯和胆固醇是血脂的主要成分，血脂含量的高低反映了机体脂类代谢水平。该试验结果表明兔血浆甘油三脂及胆固醇含量热应激72 h内持续升高，其原因可能是在热应激状态下，由于动物采食量下降，营养摄人不足，脂肪组织中脂肪的动员作用加强，储存在脂肪组织中的甘油三酯和胆固醇会快速释放入血浆，导致甘油三酯和胆固醇含量的持续上升。该试验结果与刘梅等［9］的报道基本一致。谷草转氨酶(GOT)和GPT主要存在于肝细胞和心肌细胞内，正常时其细胞内浓度高于血清1 000～3 000倍，如GOT和GPT血清活性高于生理水平，往往表示肝细胞受损，临床检测血清GOT和GPT活性已成为解肝功能受损程度最敏感的检测指标［10］。该试验条件下GPT活性极显著持续升高，说明急性持续热应激对肝脏有较

强的损伤效应，其原因可能与热应激时机体耗氧增加，自由基生成增多，对肝细胞的损害加剧有关［11］，但GOT活性降低的原因还有待进一步研究。有人认为，这可能是短期热应激时胰岛素分泌下降，使肌纤维等细胞膜的通透性降低，GOT释放到血液的量减少的缘故［12］。

3．3 急性持续热应激对兔血浆电解质的影响 该试验结果表明血清 Cl－含量增加，与刘思当等［13］和郭长江等［14］的报道基本一致，血清Cl－含量升高的原因除与采食量减少、饮水量增加有关外，还与急性热应激机体发生呼吸性碱中毒时，血液中的HCO3－进入细胞内与血清Cl－进行交换，导致血清Cl－含量增加有关;兔血浆游离钙(iCa2+)浓度降低，与李建国［15］和 Teeter等［16］报道相似，其原因可能与动物热应激时代谢性有机酸产生增加与Ca2+结合，从而导致血液中iCa2+浓度下降，也可能是热应激采食量降低，引起Ca2+摄入不足，干扰小肠粘膜上皮对Ca2+的转运等原因所致［17］;Na+和K+是维持体液渗透压、神经肌肉兴奋性及细胞外液容量的重要成分。该试验结果表明热应激24和48 h后血Na+和K+变化不明显，但热应激72 h后Na+显著降低，可能与机体较长时间采食量下降导致机体摄入量不足及机体通过汗液等其他途径排出增多有关。这说明夏季高温时适当补充电解质Na+和Ca2+等对于维持内环境稳态和提高机体的抗热应激能力有重要作用。

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