Vasohibin—1在结肠癌细胞共培养体系中对血管内皮细胞作用的研究

史刚刚　郝敬鹏　甘建琛

摘要：目的 探讨Vasohibin-1在人结肠癌细胞株SW480和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）共培养体系中对HUVECs的作用。方法 通过四甲基偶氮唑蓝评价Vasohibin-1对HUVECs的抑制作用；以流式细胞术测定HUVECs凋亡率。结果 Vasohibin-1能抑制人结肠癌细胞株SW480和HUVECs共培养体系中HUVECs增殖；流式细胞术测定显示随其浓度的增加HUVECs的凋亡率在逐渐增加。结论 Vasohibin-1能促进人结肠癌细胞株SW480与HUVECs共培养中HUVECs的凋亡。

关键词：血管生成抑制因子-1；血管内皮细胞；凋亡

Abstract：Objective To study the mechanism of Vasohibin-1 on promoting the apoptosis of human umbilical vein endothelial cells（HUVEC） in colonic cancer cell line SW480 co-culture system. Methods Tetrazolium blue was used for the evaluation on proliferation inhibition of Vasohibin-1 in HUVECs；flow cytometry was used to determine the apoptosis rate.Results Vasohibin-1 can significantly inhibit HUVECs proliferation and promote its apoptosis in SW480 co-cultured system.Conclusion Vasohibin-1 can promote HUVECs apoptosis in colonic cancer cell co-cultured system.

Key words：Vasohibin-1；Vascular endothelial cells； Apoptosis

Vasohibin-1是近年来发现的一个血管内皮生长因子-A（vascular endothelial growth factor A，VEGF-A）的负反馈调节因子，其促进血管内皮细胞的凋亡，文献报道它在多种肿瘤组织中表达[1]。但是，尚未见其对结肠癌血管内皮细胞作用的研究报道。因此，本研究建立人结肠癌细胞株SW480和人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells， HUVECs）体外共培养体系，探讨Vasohibin-1对结肠癌血管内皮细胞的抑制作用。

1 资料与方法

1.1一般资料 人结肠癌细胞株SW480（武汉博士德生物工程有限公司）、HUVECs（天津市泌尿外科研究所）；DMEM培养基（美国Gibco公司）、Vasohibin-1抗原（美国Santa Cruz公司）。Transwell迁移小室（直径6mm，孔径5μm，Corning公司）； Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒（美国BDpharmingen公司）。

1.2方法

1.2.1SW480细胞和HUVECs共培养体系的建立 取对数生长期的SW480和HUVECs，分别采用0.25%胰酶和0.02 %EDTA1∶1混合消化液进行消化，加入DMEM培养基分别制备成1×105细胞/ml的SW480单细胞悬液和5×105细胞/ml的HUVECs单细胞悬液，将6孔板Transwell小室的下室接种HUVECs，上室接种SW480细胞，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基。将Transwell板置于37℃ 5%CO2细胞培养箱中培养，建立共培养体系。

1.2.2 Vasohibin-1在共培养体系中对HUVECs的抑制作用 待下室HUVECs长至75%～85%融合度时，用含胎牛血清的DMEM培养基稀释Vasohibin-1至所需浓度。Vasohibin-1的浓度分别为5、10、20、40、80、100μg/ml，阴性对照组加100μl培养基代替，阳性对照组以贝伐单抗（终浓度30μg/ml），另设本底对照孔。待孵育48h后，弃去每孔的含药血清，重新加入1ml不含血清的培养基，另加入MTT液（5mg/ml）20μl，培养箱中孵育4h，弃去液体，每孔加入二甲基亚砜150μl，震荡溶解10min，酶标仪读取各孔吸光度A值。计算HUVECs的生长抑制率。

1.2.3流式细胞术测定HUVECs凋亡 按1.2.2接种细胞，并给予相应药物。培养48h后，根据下述步骤采用Annexin V-FITC试剂盒测定细胞凋亡：将下室HUVECs以胰酶-EDTA消化，收集细胞。每个样本至少计数1×104细胞。以500μl结合缓冲液悬浮细胞，加入5μl Annexin V-FITC，轻微混匀；测定前加入5μl PI并置于暗处避光反应15min。上机测定。

1.3统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件统计分析。所有数据均以均数±标准差（x±s）。以One-way ANOVA方差分析对各组数据进行组间差异比较。P<0.05被认为有统计学意义。

2 结果

2.1Vasohibin-1抑制HUVECs增殖 在培养48h时Vasohibin-1对HUVECs生长抑制率随着浓度的升高逐渐增加，见表1。

2.2 Vasohibin-1诱导HUVECs凋亡 Vasohibin-1处理48h后，随其浓度的增加HUVECs的凋亡率在逐渐增加。在SW480与HUVECs共培养体系中，Vasohibin-1对HUVECs 细胞具有诱导凋亡作用，见表2。

3 讨论

结肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一。近些年来，抗肿瘤血管生成的靶向治疗逐渐成为一个新的治疗方法，目前研究最多是针对VEGF-A的靶向治疗，但临床显示其疗效没有预期理想，因此，仍需研究其他的靶点、靶向药物。Vasohibin-1作为VEGF-A的一个近年来发现的负反馈调节因子，其抑制血管内皮细胞增殖[2]。而且Vasohibin-1是血管内皮细胞凋亡的主调节因子[3]。因此，研究其对结肠癌肿瘤血管内皮细胞的作用可能有重要意义。

目前有多种研究肿瘤血管内皮细胞的方法。包括将肿瘤血管内皮细胞从肿瘤组织分离后培养，其分离过程复杂，含量极少；还有条件培养基培养法，其操作简便、成本低，但是无法保证调节因子持续、有效地作用于对应细胞；而体外模拟培养的半透膜分隔培养法是将肿瘤细胞与血管内皮细胞分隔培养，它们所分泌的调节因子可以通过半透膜的小孔持续有效地发挥作用，其更符合肿瘤组织内肿瘤细胞和血管内皮细胞通过分泌可溶性因子间接作用的情况[4]。因此，我们选择了Transwell双层共培养法。

研究结果显示，在结肠癌细胞共培养体系中，Vasohibin-1能抑制HUVECs的增殖，促进HUVECs的凋亡。因此，我们可以通过增加肿瘤组织中Vasohibin-1的含量来促进肿瘤血管内皮细胞的凋亡，从而抑制肿瘤血管的生成，进而达到抑制肿瘤生长的作用。然而，我们仅仅初步探讨了Vasohibin-1对结肠癌共培养体系中肿瘤血管内皮细胞有凋亡作用，仍需更深入的研究其内在机制。

参考文献：

[1]Watanabe K，Hasegawa Y，Yamashita H，et al.Vasohibin as an endothelium-derived negative feedback regulator of angiogenesis[J]. J Clin Invest，2004，114（7）：898-907.

[2]Kern K，Steurer M，Gastl G，et al. Vasohibin inhibits angiogenic sprouting in vitro and supports vascular maturation processes in vivo[J]. BMC Cancer，2009，9：284.

[3]Affara M， Sanders D， Araki H， et al. Vasohibin-1 is identified as a master-regulator of endothelial cell apoptosis using gene network analysis[J].BMC Genomics，2013，14：23.

[4]Upreti M1， Jamshidi-Parsian A， Koonce NA，et al. Tumor-Endothelial Cell Three-dimensional Spheroids： New Aspects to Enhance Radiation and Drug Therapeutics[J].Transl Oncol，2011，4（6）：365-376.

编辑/成森