应用PCR-RDB杂交技术检测人类乳头瘤病毒基因型的临床意义

李步荣,寻 萌,段 钊,袁景奕,张 彤,李丽华

(1.西安交通大学第二附属医院检验科710004；2.西安交通大学医学院病原生物学系 710061；3.西安交通大学第二附属医院妇产科710004；4.西安交通大学第二附属医院皮肤性病科 710004)



·论 著·

应用PCR-RDB杂交技术检测人类乳头瘤病毒基因型的临床意义

李步荣1,寻 萌2,段 钊3,袁景奕4,张 彤1,李丽华1

(1.西安交通大学第二附属医院检验科710004；2.西安交通大学医学院病原生物学系 710061；3.西安交通大学第二附属医院妇产科710004；4.西安交通大学第二附属医院皮肤性病科 710004)

目的 采用聚合酶链反应(PCR)和反向斑点杂交(RDB)技术检测西安地区人类乳头瘤病毒(HPV)感染流行状态和HPV基因型分布特征。方法 共收集266例脱落细胞标本，其中尖锐湿疣86例、宫颈上皮内瘤变144例、宫颈癌36例，应用PCR-RDB杂交技术进行23种HPV基因型分型检测。结果 全部标本HPV总阳性率为71.43%(190/266)，宫颈癌HPV阳性率明显高于其他疾病，差异有统计学意义(χ2=6.297,P<0.05)；HPV阳性标本基因分型全部成功，HPV16型为主要感染基因型，其次为HPV18、6、11型；单基因型总感染率91.58%(174/190)，多基因型总感染率8.42%(16/190)。不同疾病单基因型感染和多基因型感染构成比差异无统计意义(χ2=0.3511,P>0.05)。结论 HPV16型是西安地区主要感染基因型，应用PCR-RBD技术检测HPV基因型对HPV感染的防治具有一定临床意义。

人类乳头瘤病毒； 基因分型； 聚合酶链反应； 反向斑点杂交技术

人类乳头瘤病毒(HPV)感染主要引起人皮肤和黏膜上皮细胞增生性病变，常见有尖锐湿疣、宫颈上皮内瘤变和宫颈癌等疾病。依据 HPV 致病性不同将其分为高危型(HR)和低危型(LR)两种。LR-HPV为尖锐湿疣主要致病因子，以HPV6型为主，其次是HPV11型。HR-HPV 是宫颈癌的主要发病因素，其中HPV16、18型是最为常见的基因型[1-2]。HPV 基因型流行分布有地区差异性，不同基因型具有不同的病毒生物学特性，易感人群也不尽相同[3-4]。因此，有必要对HPV感染患者进行基因分型，及时掌握西安地区HPV感染基因型分布特征，对HPV的防治和疫苗研发具有重要意义。聚合酶链反应(PCR)和反向斑点杂交 (RDB)技术在病毒基因型检测中具有特异、敏感和高通量等优点，本研究选用深圳亚能公司生产的可检测HPV23种基因型反向杂交试剂盒进行HPV基因型检测，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集 2014年1～12月于西安交通大学第二附属医院皮肤性病门诊及妇科门诊患者送检的脱落细胞标本266例，其中男51例,年龄17～76岁，平均(38.94±14.30)岁；女215例，年龄19～78岁，平均(44.71±14.72)岁。经病理学确诊，尖锐湿疣86例，宫颈上皮内瘤变144例，宫颈癌36例。

1.2 仪器与试剂 采用TC-412型TECHNE通用PCR仪(英国Bibby Scientific Limited公司)，YN-H16型分子杂交仪(深圳亚能生物技术有限公司生产)，TGL-16g高速低温离心机 (上海安亭科学仪器厂)；HPV基因分型检测试剂盒购自亚能生物技术有限公司，包括18种HR-HPV基因型(16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、83、MM4等)和5种LR-HPV基因型(6、11、42、43、44)。

1.3 取材方法 充分暴露病变部位，常规清洁消毒，用无菌棉拭子反复用力擦拭病变部位表面获取脱落细胞，将取样后的棉拭子放入装有1 mL生理盐水的无菌管中，做好标记立即送检。

1.4 PCR-RDB杂交技术

1.4.1 HPV-DNA提取 充分洗脱棉拭子上黏附的脱落细胞。加1 mL洗脱液于离心管中，13 000 r/min离心10 min，弃上清液，加入50 μL裂解液充分裂解悬浮沉淀，100 ℃恒温10 min，13 000 r/min离心10 min，保留上清液待用。

1.4.2 PCR扩增 取上清液5 μL加入装有PCR反应体系的反应管中，放入扩增仪，按以下参数进行扩增：50 ℃ 15 min；95 ℃ 10 min；(94 ℃ 30 s，42 ℃ 90 s，72 ℃ 30 s)×40 Cycles；最后72 ℃ 5 min。

1.4.3 分子杂交 取15 mL塑料离心管，加入标记膜条，加入A液(0.3 mol/L NaCl、0.03 mol/L枸橼酸钠及0.003 μmol/L SDS) 5～6 mL及PCR扩增产物25 μL，100 ℃恒温水浴10 min，51 ℃杂交至少1.5 h。

1.4.4 洗膜 取出膜条，移至装有预热B液(0.075 mol/L NaCl、 0.008 mol/L枸橼酸钠及0.003 μmol/L SDS)的50 mL管中，于51 ℃轻摇洗涤5 min。

1.4.5 孵育 取出膜条，置于孵育液中，室温轻摇孵育30 min，弃去孵育液，换A液重复2次，每次5 min。用0.1 mol/L枸橼酸钠洗膜1～2 min。

1.4.6 显色和结果判读 新鲜配制显色液。将膜条浸泡于显色液中避光显色30 min后，转移至去离子水，按试剂说明书观察判断结果，必要时可借助仪器进行结果阅读。

2 结 果

2.1 不同疾病中HPV检测结果 见表1。全部266例标本中190例HPV阳性，阳性率71.43%。尖锐湿疣HPV阳性率69.77(60/86)，宫颈上皮内瘤变阳性率68.06%(98/144)，宫颈HPV阳性率88.89%(32/36)，宫颈癌HPV感染阳性率明显高于其他疾病；不同疾病组HPV感染率差异有统计学意义 (χ2=6.297，P<0.05)。

表1 不同疾病中HPV检测结果[n(%)]

2.2 HPV基因型分布 见表2。本研究中190例HPV阳性标本均分型成功，有两种和两种以上基因型阳性者为多基因型感染，对多基因型感染者基因型阳性率进行重复计算。HPV16型为主要流行基因型，其中单基因型感染53例，多基因型感染13例。其他基因型依次为HPV18、6、11型。HPV51、59、73、83、MM4型在本研究中无论是单基因型感染还是多基因型感染都未检出。

表2 HPV基因型分布

注：-表示无数据。

2.3 不同疾病中HPV单基因型和多重基因型感染结果 见表3。在尖锐湿疣中，单基因型感染56例(93.33%)，多基因型感染4例(6.67%)；在宫颈上皮内瘤变中，单基因型感染为89例(90.82%)，多基因型感染9例(9.18%)；在宫颈癌中，单基因型感染29例(90.63%)，多基因型感染3例(9.37%)。单基因型总感染率91.58%，多基因型总感染率8.42%。不同疾病单基因型和多重基因型感染情况比较，差异均无统计学意义(χ2=0.3511,P>0.05)。

表3 不同疾病中HPV单基因型和多重基因型感染结果[n(%)]

3 讨 论

HPV是一种闭合环状双链DNA无包膜病毒，约8 Kb，HPV基因组按功能可分为早期区 (E区)、晚期区 (L区)和非编码区 (NCR)3个区域。E区分为 E1～E7开放阅读框架，主要编码与病毒复制、转录、调控和细胞转化有关的蛋白。L区分L1和L2，分别编码主要衣壳蛋白和次要衣壳蛋白。L1基因既保守又具有型特异性，是HPV基因分型目标区域。判定1个HPV新基因型需具备基因组全序列，且E6、L1、上游调控区 (URR)基因与已知HPV相应基因同源性要小于90%。迄今发现的HPV型别已经超过100多种，随着研究的深入，新的基因型不断被鉴定发现[5]。不同基因型与所致疾病特点之间的关系逐步成为目前研究的热点和难点。

HPV不能在体外培养，不能通过血清学方法进行分型。PCR-RDB分子杂交技术是一种微量DNA分析技术，对实验室和仪器设备要求相对不高，可以在分子诊断实验室广泛开展。本研究所用试剂原理是在尼龙膜上固定了 23种HPV型特异性探针及一个β球蛋白作为对照探针，和PCR扩增的DNA片段按碱基配对原则进行核酸杂交，即可快速、准确区分HPV基因型。此方法不仅实现了HPV感染的快速检测，同时又可以进行HPV基因分型，还可以确定是单基因型感染还是多重基因型感染，极大简化了基因诊断的试验流程[6]。对于试验未能区分HPV基因型的标本，应进行病毒基因测序，通过核酸序列比对最终确定其基因型。本研究全部标本都能成功分型，说明本试剂盒检测范围基本包含了西安地区流行的HPV基因型，满足了当前试验要求。

HPV 基因型的分布存在人种和地域差异，不同基因型感染其致病性不同。本研究对象包含了由HPV感染所引起的几种常见疾病，通过检测其基因型，基本能够反映西安地区HPV基因型的流行趋势和分布状况。本研究结果显示，宫颈癌HPV阳性率明显高于尖锐湿疣和宫颈上皮内瘤变，差异有统计学意义(χ2=6.297，P<0.05)。单基因型总感染率91.58%，多基因型感染率8.42%，单基因型感染是主要感染类型。在不同疾病间单基因型感染和多基因型感染构成比差异无统计学意义 (χ2=0.351 1,P>0.05)，本研究结果与国内外其他地区比较有一定差异[7-12]。本研究并未对宫颈上皮内瘤变患者进行疾病分级比较，主要是因为标本量少，分层后研究结果不能全面反映实际情况。本研究发现，无论是高危型还是低危型HPV，在各种疾病中都有检出，多基因型感染既可以是低危型或者高危型之间的复合感染，也可以是低危型和高危型之间复合感染。HPV16型为本研究最常见基因型，其次为HPV18型，这有可能与所选研究对象中宫颈癌和宫颈上皮内瘤变患者较多有关。在尖锐湿疣中，HPV6型和HPV11型是主要感染基因型，不同疾病HPV主要流行基因型存在一定差异。

目前，HPV感染致病机制尚不完全明确，各种治疗手段不能完全控制和消灭HPV的感染和流行。我国地域辽阔、人口基数大，随着经济飞速发展，人员流动增加，HPV感染基因型分布是一个动态变化状态。不同地区感染HPV基因型分布资料还不够全面，仍需通过进行HPV基因型检测进一步完善其流行病学资料，为人类最终消灭HPV感染提供科学的实验室依据。

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Clinical significance of genotyping detection of human papillomavirus by using PCR-RDB

LIBu-rong1,XUNMeng2,DUANZhao3,YUANJing-yi4,ZHANGTong1,LILi-hua1

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,SecondAffiliatedHospital,Xi′anJiaotongUniversity,Xi′an,Shaanxi710004,China;2.DepartmentofPathogenicBiology,SchoolofMedicine,Xi′anJiaotongUniversity,Xi′an,Shaanxi710061,China;3.DepartmentofObstetricsandGynecology,SecondAffiliatedHospital,Xi′anJiaotongUniversity,Xi′an,Shaanxi710004,China;4.DepartmentofDermatologyandVenerealDisease,SecondAffiliatedHospital,Xi′anJiaotongUniversity,Xi′an,Shaanxi710004,China)

Objective To study the HPV infection situation and its genotype distribution characteristics in Xi′an by using polymerase chain reaction (PCR) and reverse dot blot (RDB) technology.Methods 266 samples of exfoliative cells were collected,including 86 cases of condyloma acuminatum,144 cases of cervical intraepithelial neoplasia (CIN) and 36 cases of cervical cancer.23 kinds of HPV genotyping detection were performed by using PCR-RDB.Results The total positive rate of HPV in all of the samples was 71.43%(190/266).The HPV positive cases in cervical cancer was significantly higher than that in the other diseases (χ2=6.297,P<0.05).Genotyping in the HPV positive samples was successfully conducted.HPV16 was the most predominant genotype,the next genotypes were HPV18,6 and 11.The overall infection rate of single HPV genotype was 91.58%(174/190),which of multiple HPV genotypes was 8.42%(16/190).There was no statistically significant difference of the constituent ratio between single genotype infection and multiple genotype infection in different diseases (χ2=0.351 1,P>0.05).Conclusion HPV16 is the main infection genotype in Xi′an area.Detection of HPV genotypes by using PCR- RDB technology has certain significance to the prevention and treatment of HPV infection.

human papillomavirus; genotyping; PCR； reverse dot blot

李步荣,男,博士,副主任检验师,主要从事病毒分子生物学诊断工作。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.24.028

A

1672-9455(2015)24-3684-03

2015-04-22

2015-07-25)