刘 博,董 超,米 阳,侯正欣
(1.河北省灵寿县中西医结合医院 妇产科,河北 灵寿 050500; 2.河北省科学院 生物研究所,河北 石家庄 050081)
产纤溶酶的海洋放线菌小鼠急毒和抗生素敏感实验
刘 博1,董 超2,米 阳2,侯正欣2
(1.河北省灵寿县中西医结合医院 妇产科,河北 灵寿 050500; 2.河北省科学院 生物研究所,河北 石家庄 050081)
介绍了检测产纤溶酶的放线菌株MY0504的毒性和抗生素敏感性的实验。通过液体摇瓶发酵得到MY0504的发酵液,分别小鼠灌胃发酵原液和除去菌提到发酵液;采用抗生素抑制菌圈法测试了5种抗生素对MY0504菌株的生长影响。结果表明小鼠灌胃给药的最大给药量为80ml/kg,该受试物毒性较小;MY0504对常用抗生素比较敏感。
海洋放线菌;急毒实验;抗生素敏感
血栓导致的心脑血管病一般表现为心梗和中风,现在临床的治疗方案还是以溶栓为主,溶栓药物包括链激酶(SK)、尿激酶(UK)、蚓激酶、葡激酶、组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)和瑞替普酶,还有目前研究较热的纳豆激酶等,它们在不同方面存在一定缺陷,如有免疫反应、对血液纤维蛋白专一性差、半衰期短或价格昂贵等[1]。
海洋蕴藏着丰富的微生物资源,绝大多数的海洋微生物还没被人类认识和培养。由于海洋的高盐、低温、低营养等特殊环境,海洋微生物的代谢途径与陆地微生物差异较大,可以产生特殊结构的次级代谢产物[2]。我们从从渤海湾海泥样本中筛选得到了一株产产纤溶酶的放线菌株MY0504,分泌的纤溶酶分子量小,约15KD。液体深层发酵的纤溶酶活性可以达到500U/mL左右。为了检测菌株发酵液的安全性,我们采用小鼠灌胃检测了其急毒剂量,采用了5种常用的抗生素,检测了其敏感性。促进了该菌株在纤溶酶药物方面的应用开发。
1.1 材料与仪器
牛纤维蛋白原(Sigma公司);凝血酶(石家庄市华瑞创新生物科技开发中心);注射用尿激酶(辽宁卫星制药厂有限责任公司) ;台式保温培养箱(PW/10-002重庆实验设备厂);青霉素、杆菌肽:华北制药集团股份有限公司;四环素:北京赛孚制药股份有限公司;环丙沙星、庆大霉素:新乡市常乐制药责任有限公司。
1.2 动物试验条件
受试物:放线菌液原液A和放线菌液过滤液B,河北省科学院生物研究所提供。
试验地点:河北中医学院中药药理实验室,实验动物使用许可证SYXK(冀)2011-0047。
动物种系:昆明种小鼠(清洁级),动物合格证号为1410006。
动物级别:SPF级。
动物性别和数量:雌雄各半,体重18-20g。
饲养条件:光照12h/d,温度20~25℃,相对湿度40~70%。笼养,4只/笼。
检疫过程:新领到的动物检疫期5d。在检疫期间观察动物饮水、摄食和健康状况,以及是否存在疾病和死亡征兆。
饮水:普通用水灌装饮水瓶,供动物自由饮用。每日冲洗饮水瓶并换水一次。
垫料:购自河北省实验动物中心,隔日更换。
动物标识:动物识别采用5%苦味酸标记。
1.2 试验方法
1.2.1 预试验测定LD50
采用A和B液分别设定灌胃量1.0、5.0、10.0、30.0、60.0 ml/kg,观察小鼠24h内产生的急性毒性反应,为临床安全用药提供参考信息[3]。
1.2.2 最大剂量灌胃试验[4]
取小鼠40只,雌雄各半,随机分为两组,每组20只,分别为对照组和给药组.各组小鼠均禁食24h,然后给药组小鼠用放线菌液A和B分别灌胃,容量为0.4ml/10g体重(最大容量),一天共给药二次,累积剂量为80ml/kg,对照组小鼠给予等容量净化水,观察给药后14d内动物一般状态,毛色、体重、饮食、活动、呼吸、运动、反射、眼检指征、心血管指征、唾液分泌、排便等指标变化。
1.2.3 常用抗生素对目标菌株的抑制作用
将MY0504菌株的孢子用接种环挑取少部分在10ml无菌水中稀释,高速摇匀,备用。将100mlPB培养基化开降温到45℃左右,加入2ml备用的孢子菌液,摇匀,铺平板。配制如下抗生素的溶液(浓度见表5) :青霉素、四环素、环丙沙星、庆大霉素、杆菌肽。取10μL点到上述平板上,24℃恒温培养3天,测定抑菌圈的大小。
2.1 预试验测定LD50
经预试各小鼠均正常,未见死亡或其它不适状态,所以无法测出LD50,故需要进行最大给药量试验。
2.2 最大剂量灌胃试验
A液灌胃结果见表1、表2,B液结果灌胃结果见表3、表4。结果显示各组小鼠在14d内一般状态良好,毛色光滑,饮食及活动未见异常,呼吸、运动、反射、眼检指征、心血管指征、唾液分泌、排便等指标均正常;给药后第7d、第14d,给药组雄性小鼠体重均较对照组降低(P<0.01);给药组雌性小鼠体重均无明显差异(P>0.05);但试验期间各组均无一死亡,未发现明显毒性反应,其小鼠灌胃给药的最大给药量为80ml/kg。
表1 A液灌胃各组小鼠体重变化
与对照组比较 *P<0.05 **P<0.01
表2 A液灌胃各组小鼠进食量变化 (g/只, n=10)
表3 B液灌胃各组小鼠体重变化
与对照组比较 *P<0.05 **P<0.01
表4 B液灌胃各组小鼠进食量变化 (g/只, n=10)
2.3 MY0504菌株对常用抗生素的敏感性实验结果
抗生素周边某一直径的抑菌圈表示对药物敏感,小于或根本没有说明该菌株对抗生素有抗性。采用Kirby-Bauer的检测方法[5],参照各抗生素的敏感直径得出MY0504的敏感程度如表5所示。由表5可知,该菌株对这几种抗生素比较敏感,尤其对喹诺酮类的环丙沙星敏感。所以该菌株的实验开发等是相对安全的,不会引起不可控制的感染等,这也利于该菌株的纤溶酶发酵应用。
表5 菌株MY0504对常用抗生素的敏感程度
注:“+”为敏感,“++”为非常敏感
(1)海洋放线菌MY0504产纤溶酶,并且小鼠急毒试验发现,该菌株的发酵液和菌体均可以达到小鼠灌胃最大量,无死亡和不适状态,所以该菌株安全无毒。
(2)菌株MY0504对常用抗生素敏感,尤其是对喹诺酮类抗生素敏感,所以该菌株对环境安全,在实验和生产过程中不会引起不可控感染。
(3)海洋微生物由于环境特殊,一般的产物不同于陆地微生物。作为一株纤溶酶药物应用开发菌株,MY0504分泌的纤溶酶分子量小,易吸收,相关发酵优化和提取技术研究需要进一步的工作。
[1] Kunamneni A,Ravuri B D,Saisha V,et al.Urokinase-a very popular cardiovascular agent[J].Recent Pat Cardiovase Drug Discov,2008,3(1):45-58.
[2] Knight V,Sanglier J J,Ditullio D,etal.Diversifying microbial natural products for drug discovery.Appl Microbiol Biotechnol,2003,1-28.
[3] 中药、天然药物急性毒性研究技术指导原则,编号[Z]GPT2-1,2005,3.
[4] 陈奇.中药药理研究方法学[M].北京:人民卫生出版社(第二版),2006.
[5] .P.哈雷.图解微生物实验指南[M].北京:科学出版社,2012.
Mice acute toxicity and antibiotic sensitivity tests of a plasmin-producing marine actinomycete
LIU Bo1,DONG Chao2,MI Yang2,HOU Zheng-xin2
(1.ObstetricsandGynecologyofIntegrativeMedicineHospitalinLingshou;LingshouHebei050500,China; 2.InstituteofBiology,HebeiAcademyofSciencesShijiazhuangHebei050081,China)
To detect the toxicity and antibiotic sensitivity of a actinomycete MY0504 which can produce plasmin. Fermented liquid of MY0504 was obtained by liquid shake-flask fermentation, respectively fed mice fermented liquid and broth which is removed actinomycetes ; the effect of five kinds of antibiotics on the growth of MY0504 was tested by inhibition zone method. The maximum tolerant dosage of mice was 80ml/kg, it showed that the test substances was low toxicity; MY0504 is sensitive to commonly used antibiotics.
Marine actinomycete; Acute toxicity test; Antibiotic sensitivity
2015-06-30
河北省科技支撑项目(No:14273201D)
刘 博(1964-),女,河北灵寿人,主治中医师,主要从事中医妇科,特别是妇产血栓性疾病治疗研究.
1001-9383(2015)03-0070-04
Q936
A