产纤溶酶的海洋放线菌小鼠急毒和抗生素敏感实验

刘 博，董 超，米 阳，侯正欣

(1.河北省灵寿县中西医结合医院 妇产科，河北 灵寿 050500； 2.河北省科学院 生物研究所,河北 石家庄 050081)

产纤溶酶的海洋放线菌小鼠急毒和抗生素敏感实验

刘 博1，董 超2，米 阳2，侯正欣2

(1.河北省灵寿县中西医结合医院 妇产科，河北 灵寿 050500； 2.河北省科学院 生物研究所,河北 石家庄 050081)

介绍了检测产纤溶酶的放线菌株MY0504的毒性和抗生素敏感性的实验。通过液体摇瓶发酵得到MY0504的发酵液，分别小鼠灌胃发酵原液和除去菌提到发酵液；采用抗生素抑制菌圈法测试了5种抗生素对MY0504菌株的生长影响。结果表明小鼠灌胃给药的最大给药量为80ml/kg，该受试物毒性较小；MY0504对常用抗生素比较敏感。

海洋放线菌；急毒实验；抗生素敏感

血栓导致的心脑血管病一般表现为心梗和中风,现在临床的治疗方案还是以溶栓为主，溶栓药物包括链激酶(SK)、尿激酶(UK)、蚓激酶、葡激酶、组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)和瑞替普酶，还有目前研究较热的纳豆激酶等，它们在不同方面存在一定缺陷，如有免疫反应、对血液纤维蛋白专一性差、半衰期短或价格昂贵等[1]。

海洋蕴藏着丰富的微生物资源，绝大多数的海洋微生物还没被人类认识和培养。由于海洋的高盐、低温、低营养等特殊环境，海洋微生物的代谢途径与陆地微生物差异较大，可以产生特殊结构的次级代谢产物[2]。我们从从渤海湾海泥样本中筛选得到了一株产产纤溶酶的放线菌株MY0504，分泌的纤溶酶分子量小，约15KD。液体深层发酵的纤溶酶活性可以达到500U/mL左右。为了检测菌株发酵液的安全性，我们采用小鼠灌胃检测了其急毒剂量，采用了5种常用的抗生素，检测了其敏感性。促进了该菌株在纤溶酶药物方面的应用开发。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牛纤维蛋白原(Sigma公司)；凝血酶(石家庄市华瑞创新生物科技开发中心)；注射用尿激酶(辽宁卫星制药厂有限责任公司) ；台式保温培养箱(PW/10-002重庆实验设备厂)；青霉素、杆菌肽：华北制药集团股份有限公司；四环素：北京赛孚制药股份有限公司；环丙沙星、庆大霉素：新乡市常乐制药责任有限公司。

1.2 动物试验条件

受试物：放线菌液原液A和放线菌液过滤液B，河北省科学院生物研究所提供。

试验地点：河北中医学院中药药理实验室，实验动物使用许可证SYXK(冀)2011-0047。

动物种系：昆明种小鼠(清洁级)，动物合格证号为1410006。

动物级别：SPF级。

动物性别和数量：雌雄各半，体重18-20g。

饲养条件：光照12h/d，温度20～25℃，相对湿度40～70%。笼养，4只/笼。

检疫过程：新领到的动物检疫期5d。在检疫期间观察动物饮水、摄食和健康状况，以及是否存在疾病和死亡征兆。

饮水：普通用水灌装饮水瓶，供动物自由饮用。每日冲洗饮水瓶并换水一次。

垫料：购自河北省实验动物中心，隔日更换。

动物标识：动物识别采用5%苦味酸标记。

1.2 试验方法

1.2.1 预试验测定LD50

采用A和B液分别设定灌胃量1.0、5.0、10.0、30.0、60.0 ml/kg，观察小鼠24h内产生的急性毒性反应，为临床安全用药提供参考信息[3]。

1.2.2 最大剂量灌胃试验[4]

取小鼠40只，雌雄各半，随机分为两组，每组20只，分别为对照组和给药组．各组小鼠均禁食24h，然后给药组小鼠用放线菌液A和B分别灌胃，容量为0.4ml/10g体重(最大容量)，一天共给药二次，累积剂量为80ml/kg，对照组小鼠给予等容量净化水，观察给药后14d内动物一般状态，毛色、体重、饮食、活动、呼吸、运动、反射、眼检指征、心血管指征、唾液分泌、排便等指标变化。

1.2.3 常用抗生素对目标菌株的抑制作用

将MY0504菌株的孢子用接种环挑取少部分在10ml无菌水中稀释，高速摇匀，备用。将100mlPB培养基化开降温到45℃左右，加入2ml备用的孢子菌液，摇匀，铺平板。配制如下抗生素的溶液(浓度见表5) ：青霉素、四环素、环丙沙星、庆大霉素、杆菌肽。取10μL点到上述平板上，24℃恒温培养3天，测定抑菌圈的大小。

2 试验结果

2.1 预试验测定LD50

经预试各小鼠均正常，未见死亡或其它不适状态，所以无法测出LD50，故需要进行最大给药量试验。

2.2 最大剂量灌胃试验

A液灌胃结果见表1、表2，B液结果灌胃结果见表3、表4。结果显示各组小鼠在14d内一般状态良好，毛色光滑，饮食及活动未见异常，呼吸、运动、反射、眼检指征、心血管指征、唾液分泌、排便等指标均正常；给药后第7d、第14d，给药组雄性小鼠体重均较对照组降低(P<0.01)；给药组雌性小鼠体重均无明显差异(P>0.05)；但试验期间各组均无一死亡，未发现明显毒性反应，其小鼠灌胃给药的最大给药量为80ml/kg。

表1 A液灌胃各组小鼠体重变化

与对照组比较 *P<0.05 **P<0.01

表2 A液灌胃各组小鼠进食量变化 (g/只， n=10)

表3 B液灌胃各组小鼠体重变化

与对照组比较 *P<0.05 **P<0.01

表4 B液灌胃各组小鼠进食量变化 (g/只， n=10)

2.3 MY0504菌株对常用抗生素的敏感性实验结果

抗生素周边某一直径的抑菌圈表示对药物敏感，小于或根本没有说明该菌株对抗生素有抗性。采用Kirby-Bauer的检测方法[5]，参照各抗生素的敏感直径得出MY0504的敏感程度如表5所示。由表5可知，该菌株对这几种抗生素比较敏感，尤其对喹诺酮类的环丙沙星敏感。所以该菌株的实验开发等是相对安全的，不会引起不可控制的感染等，这也利于该菌株的纤溶酶发酵应用。

表5 菌株MY0504对常用抗生素的敏感程度

注：“+”为敏感，“++”为非常敏感

3 结论

(1)海洋放线菌MY0504产纤溶酶，并且小鼠急毒试验发现，该菌株的发酵液和菌体均可以达到小鼠灌胃最大量，无死亡和不适状态，所以该菌株安全无毒。

(2)菌株MY0504对常用抗生素敏感，尤其是对喹诺酮类抗生素敏感，所以该菌株对环境安全，在实验和生产过程中不会引起不可控感染。

(3)海洋微生物由于环境特殊，一般的产物不同于陆地微生物。作为一株纤溶酶药物应用开发菌株，MY0504分泌的纤溶酶分子量小，易吸收，相关发酵优化和提取技术研究需要进一步的工作。

[1] Kunamneni A,Ravuri B D,Saisha V,et al.Urokinase-a very popular cardiovascular agent[J].Recent Pat Cardiovase Drug Discov,2008,3(1):45-58.

[2] Knight V,Sanglier J J,Ditullio D,etal.Diversifying microbial natural products for drug discovery.Appl Microbiol Biotechnol,2003,1-28.

[3] 中药、天然药物急性毒性研究技术指导原则，编号[Z]GPT2-1，2005,3.

[4] 陈奇.中药药理研究方法学[M].北京：人民卫生出版社(第二版)，2006.

[5] .P.哈雷.图解微生物实验指南[M].北京：科学出版社，2012.

Mice acute toxicity and antibiotic sensitivity tests of a plasmin-producing marine actinomycete

LIU Bo1,DONG Chao2,MI Yang2,HOU Zheng-xin2

(1.ObstetricsandGynecologyofIntegrativeMedicineHospitalinLingshou;LingshouHebei050500,China; 2.InstituteofBiology,HebeiAcademyofSciencesShijiazhuangHebei050081,China)

To detect the toxicity and antibiotic sensitivity of a actinomycete MY0504 which can produce plasmin. Fermented liquid of MY0504 was obtained by liquid shake-flask fermentation, respectively fed mice fermented liquid and broth which is removed actinomycetes ; the effect of five kinds of antibiotics on the growth of MY0504 was tested by inhibition zone method. The maximum tolerant dosage of mice was 80ml/kg, it showed that the test substances was low toxicity; MY0504 is sensitive to commonly used antibiotics.

Marine actinomycete; Acute toxicity test; Antibiotic sensitivity

2015-06-30

河北省科技支撑项目(No:14273201D)

刘 博(1964-),女，河北灵寿人，主治中医师，主要从事中医妇科，特别是妇产血栓性疾病治疗研究.

1001-9383(2015)03-0070-04

Q936

A