诱发性大鼠肝癌模型的建立

杨新宇，徐蓓蕾，2，沈 芸

(1.哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心，哈尔滨150076;2.哈尔滨商业大学药学院，哈尔滨150076)

原发性肝癌(primary hepatic carcinoma，PHC)是一种常见的肝癌，也是一种严重的消化道恶性肿瘤，严重危害人类生命健康，据查每年因PHC死亡的人数达到59.8万人，且随着社会环境的变化，其发病率逐步提高[1].PHC在初期病症不明显，肝癌细胞发展迅速，确诊时患者多已转化成局部晚期，不利于治疗，迄今发病机制尚未完全阐明，因此，探究原发性肝癌的发病机理并开展新的治疗方案是目前一重大科学问题.

为模拟人类肝癌的发生过程，国内外学者对动物原发性肝癌模型的建立进行研究，以求得到死亡率低、诱癌时间短、成功率高、操作方便的最佳模型方案.实验动物包括小鼠、大鼠、仓鼠、猪等用以建造肝癌模型;随着人们对肝癌实验动物模型不断深入的研究，先后出现了自发性动物肝癌模型、诱发性动物肝癌模型、移植型动物肝癌模型和转基因动物肝癌模型[2].由于使用诱癌剂的计量和实验条件可以人为控制，诱发率远高于自然发生率，实验成本较低，更贴近于人肝癌发病过程，国内外多用诱发性动物肝癌模型，即采用化学、物理或生物的致癌因素作用于动物而形成的肝癌[3].致癌化合物可单一应用也可联合应用，多见二乙基亚硝胺同2－乙酰氨基芴联用，结合2/3肝切除技术制备solt farber模型，可提高造模成功率，缩短诱癌时间.本文结合近年相关文献加以总结分析，就诱发性大鼠肝癌模型的建立方法进行综述.

1 单一诱癌剂诱癌法

化学药物具有能与细胞DNA结合的化学能团，故能诱发细胞损伤、变性、坏死，进而发生癌变.常用的诱癌剂包括二乙基亚硝胺(DEN)、2－乙酰氨基芴(2－AAF)、二甲基氨基偶氮苯(DAB)、黄曲霉素(AFB1)、亚胺基偶氮甲苯(OAAT)等[4].

1.1 二乙基亚硝胺诱癌法

二乙基亚硝胺是亚硝胺类诱导剂[5]，诱发的大鼠原发性肝癌是经历肝炎、肝硬化的基础上形成的，类似于人肝癌的发生过程，对肝癌的致癌性较专一，给药途径多经口给药和腹腔注射.

经口给药的途径分为口服和灌胃，各有其优缺点:口服药物相对方法简单，多将药物溶于饮用水中供大鼠自由摄取.Sundaram等[6]采用口服DEN诱导大鼠肝脏癌变的方法，实验组大鼠连续饮用浓度为0.01%DEN溶液，在第16周成功诱发肝癌，肝脏表面有大小不等的结节.持续服用二乙基亚硝胺溶液可致大鼠死亡率增高，为解决此问题张志敏等[7]在传统的二乙基亚硝胺诱癌法的基础上进行了改进，在大鼠间断饮用1%DEN溶液5周后，改饮用一般的灭菌食用水3周，再继续饮1%的DEN溶液12周停药.通过动态观察大鼠肝脏不同诱癌阶段的病理变化，发现改良方法后的大鼠诱癌成功率明显提高，通过设立诱癌间歇期给大鼠肝脏一定时间的休息，从而降低了大鼠的死亡率.以口服为主要途径的DEN诱癌法虽然可致肝脏表面发生癌变，但也存在诱癌周期相对较长且剂量不可控的缺点.

另一种经口给药方法既灌胃给药途径则可以避免剂量不可控的缺点.朱丹丹等[8]配制35 mg/kg DEN溶液，每周灌胃给药2次，共16周，经HE染色后光镜下放大400倍观察，可见有不同程度肝细胞坏死、变性，纤维组织增生，癌变肝细胞呈灶状、巢状或条索状分布，造模成功率高达90.5%.不过长期灌胃给药容易损伤大鼠机体并造成心理上影响，为尽可能减少该因素造成的后果，赵金璐等[9]将灌胃和口服共同使用，先给以10 mg/kg/体重DEN灌胃一次，后给以0.025%DEN自由饮用20周完成造模.无论口服还是灌胃，诱癌剂都会对大鼠肝脏造成一定的损伤，选择经口给药的这两种途径时均应结合具体情况而抉择.

除了经口给药的两种给药方式，腹腔注射也是常用给药途径之一，诱癌剂可溶解或混悬于相应溶剂中，注入腹腔.Seong Tae Park等[10]用腹腔注射DEN的方法制造SD大鼠原发性肝癌模型，每周注射一次，每次按50 mg/kg给药，共16周，给药后第10周，显微镜下可观察到肝门－中央静脉桥接纤维化，自12周起，纤维化越发明显，并在第14周变成肝硬化，给药16周后肝表面出现直径3毫米的恶性结节和畸形块儿，通过一系列的组织学检查，最终确定为高分化的肝细胞癌.Bram等[11]在研究原发性肝癌大鼠体内血清蛋白N－糖链变化时采用腹腔注射DEN的方法建模，模型组大鼠每周注射DEN溶液35 mg/kg一次，对照组每周注射生理盐水1次，在第16周取血样，确定肝脏表面发生癌变.为了提高大鼠原发性肝癌模型建造的效率，Lee等[12]采用腹腔注射 DEN 50 mg/kg，每周5次，连续注射6周的方法造模.腹腔注射的给药途径可对剂量有所掌控，根据动物不同的耐受度可调整注射剂量和间隔时间，既可选择单次注射大剂量的方法又能连续小剂量注射.

DEN诱癌法因其成模率较高、专一性较强、是迄今应用最广的肝癌模型之一.因其造模周期较长，一般多用体重200 g以下、鼠龄3个月以内的雄性大鼠，体重较大则不易诱发癌变.

1.2 2－乙酰氨基芴诱癌法

2－AAF可对大鼠造成明显的肝功能损害，是有效的肝癌诱导剂[13]，常见口服、灌胃和腹腔注射3种给药途径，不过相比于二乙基亚硝胺、黄曲霉素B1等诱癌剂，其诱癌专一性相对较差.信涛等[14]取50只 Wistar大鼠，所食饲料中含 0.03%2－AAF，每日平均每只大鼠摄入2～3 mg，维持3－4个月，B超检测其中有32只诱发癌变.Leite等[15]应用腹腔注射2－AAF的方法建造肝损伤模型，分别在第2、4、7、9天腹腔注射 25 mg的 2－AAF，并于处死前2 h一次注射1 mL/kg的烯丙醇，在显微镜下观察可见有大小不等的增生性结节形成.2－乙酰氨基芴是油溶性试剂，实验时多与橄榄油配成混悬液，在灌胃给药及腹腔注射过程中，由于橄榄油等溶剂不利于消化，造模周期不宜过长，顾单用2－AAF诱发原发性肝癌的应用相对较少，多见CCl4增敏的2－AAF模型及DEN联合2－AAF诱导的肝癌模型.

2 多种诱癌剂联合诱癌法

通过不同诱癌剂依次作用，可提高大鼠原发性肝癌模型建立的效率，缩短造模时间，更容易致肝损伤或癌变.例如联合应用CCl4和DEN建立的大鼠肝癌模型，过程类似于人类乙型肝炎病毒感染过程[16]，且动物死亡率低、诱癌时间短、成功率高、操作方便，方法值得推广.陈波等[17]先给予50%CCl4油溶液0.3 mL/100 g后肢皮下注射，每周2次，注射2周，再休息2周之后，给予95 μg/mL的DEN自由饮水12周，实验过程无大鼠死亡.Chiu等[18]为研究卵圆细胞同肝癌诱发的关系，在实验中也加入了CCl4作促进剂.先将2－AAF溶解于少量的二甲基亚砜中，再溶于橄榄油中，配制成10 mg/mL的混悬液，以10 mg/kg剂量连续灌胃给药2－AAF 4 d，在第5天以0.6 mL/kg剂量腹腔注射 CCl4，之后再灌胃给药2－AAF 5 d，促进卵圆细胞的增殖和分化，进而生成具有结节的灶肝细胞.CCl4增敏的2－AAF诱导大鼠原发性肝癌模型的建立已被广泛应用，解决了2－AAF在大鼠体内消化困难的问题.

3 Solt－Farber模型法

肝癌的发生是阶段性的，大多分为启动、促进和演进三个阶段[19]，国外学者于20世纪70年代提出两阶段肝癌发生模型，既先启动后促进的过程，并将其不断完善，现多见 Solt－Farber[20]大鼠原发性肝癌模型法，该方法最初由Solt DB及Farber E[21]基于卵圆细胞理论在1977年提出，Farber发现一类细胞体型较小，细胞器少，核仁呈卵圆形的细胞，其分化与增殖多发生在肝损伤后，即卵圆细胞.肝脏很强的再生能力和卵圆细胞的增殖分化密不可分[22]，当肝损伤严重时，肝组织可通过卵圆细胞的增殖并分化成肝细胞和胆管上皮细胞来完成肝脏再生，这些细胞可能来源于肝细胞胆小管系统和胆管树之间的赫林管[23].基于该理论，当给予大鼠DEN或2－AAF等化学药物刺激时，肝细胞增殖被抑制，此时卵圆细胞便开始增殖，之后将肝脏部分切除，致使肝脏受损，可进一步促进卵圆细胞的增殖和分化，新生细胞由于被药物刺激，容易导致肝硬化等疾病，进而形成原发性肝癌.Solt－Farber模型既建立在这样的理论基础上，是最常见的卵圆细胞活化模型，被广泛应用于原发性肝癌疾病研究中.造模分为三步骤:首先一次性注射启动剂DEN，一定剂量下肝细胞被启动，1至2周后进入选择性促进程序，2/3肝切除，切除后剩余肝叶的肝细胞发生代偿性增生，2－AAF抑制正常未被启动的干细胞代偿性增生，而已致癌的肝细胞具有抵制2－AAF的作用，切除后迅速增生，最终达到肝脏癌变的作用.

国内外学者对Solt－Farber模型法的应用较灵活，为了减少造模时间，或减少动物死亡率，大多对该方法进行了一定量的改进，多见省略DEN给药步骤或2－AAF给药步骤.Mi－Ae Bang等[24]将DEN溶于生理盐水中，向SD大鼠以200 mg/kg剂量腹腔注射DEN溶液，饲养3周时切除2/3肝脏，再饲养6周隔夜禁食后断头处死大鼠完成造模.Watanabe等[25]利用肝切除加给药2－AAF的方法制造卵圆细胞增值模型，首先连续灌胃给药2－AAF(10 mg/kg/day)4 d，在第5天的时候进行肝切除手术，切除2/3肝脏，第6天起，再连续给药2－AAF如上剂量4 d.无论是省去DEN诱癌剂的步骤，还是省略2－AAF给药的步骤，都可加快造模时间，但只易致肝损伤，致癌几率相对较小.

在给药剂量及给药方式上，国内外学者也就其进行改进，以获得更明显的肝癌模型.Hayashi等[26]先以150mg/kg剂量腹腔注射DEN，经2周恢复期后，每天灌胃给药2－AAF两次，每次剂量7.5 mg/kg，持续1周，造模第3周将部分肝脏切除，术后第二天起继续以相同剂量给药2－AAF 1周.其通过每日两次灌胃给药2－AAF的方法促进诱癌剂的吸收和代谢，相比于单剂量给药15 mg/kg/day的给药方式，分批灌胃所至大鼠原发性肝癌效果更明显.Srivastava等[27]为研究茶多酚对大鼠肝癌前病灶的抑制作用，采用改进的Solt－Farber模型，既在腹腔注射200 mg/kg剂量的DEN一周后，用含0.05%2－AAF的饲料喂养大鼠，饲养一周后切除2/3肝脏，继续用含药饲料喂养大鼠，于实验第8周处死大鼠，取出肝脏，置于－80℃环境保存.应用饲料喂养(既口服给药)的给药方式不但解决了2－AAF油溶后不宜消化的问题，还降低了大鼠的死亡率，但致癌周期相对较长.Malik等[28]在Solt－Farber模型基础上，除去了部分肝脏切除步骤，先以200 mg/kg剂量腹腔注射大鼠，恢复1周后，第一组以150 mg/kg剂量灌胃给药2－AAF3 d，在实验第30天处死大鼠;第二组给药6天，实验第60天处死大鼠，第三组给药9 d，实验第90天处死大鼠，第四组给药12 d，实验第120天处死大鼠.实验结果显示，除去肝脏切除步骤的模型在第一个月诱导并启动了癌变，大鼠有掉毛的表观特征，而且摄食量明显减少，不过第一个月癌前病灶率不明显，在第四个月时肝脏表面出现明显的结节.

阶段性肝癌模型建立的方法除了Solt－Farber模型法外，还有Scherer－ Emmelot模型、Gedans模型等，分阶段肝癌模型不但能用于肝癌早期的研究，还能用于致癌物和促癌物的检测及抑癌物的筛选.由于Solt－Farber模型法诱癌成功率高、周期短、方法简单，起病多为弥漫结节型，伴有肝硬化，和人肝癌的发病过程类似，已被国内外学者公认为较好的肝癌模型.

4 结语

诱发性大鼠肝癌模型的诱癌因素可人为控制，诱癌剂和诱癌方法种类较多，特点不一，各有优缺点，所以在选择模型时应根据具体实验需求选择模型种类.单用诱癌剂的造模方法有着造模周期长，常见2～5个月，模型建立过程动物死亡率高的缺点;多种诱癌剂联合应用时可以缩短诱癌时间，但多见肝损伤，肝癌成模率相对较低;而Solt－Farber法不但造模所需时间短，动物死亡率低，而且结合2/3肝切除加重了肝脏的损伤程度，模型致癌率明显增高，是国内外较为认可的大鼠原发性肝癌模型.随着科学技术的发展，诱发大鼠原发性肝癌模型的建立方法日益完善，其诱癌过程更接近于人肝癌的发病过程，从而为临床应用研究及肝癌药物的研发提供理论基础.

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