长期注射水杨酸钠对大鼠听皮层酪氨酸受体激酶B及c-fos基因表达的影响*

李锦秀杨琨吴莎华清泉

·实验研究·

长期注射水杨酸钠对大鼠听皮层酪氨酸受体激酶B及c-fos基因表达的影响*

李锦秀1杨琨1吴莎1华清泉1

目的 通过观察长期注射水杨酸钠后大鼠听皮层中酪氨酸受体激酶B（Trk B）及c-fos基因的表达，探讨其在水杨酸钠耳毒性机制中的作用。方法 健康成年Wistar大鼠36只，分为正常组（不做任何处理）、慢性组（肌肉注射水杨酸钠175 mg／kg，2次／天，时间间隔8小时，连续注射14天）、慢性恢复组（前期处理同慢性组，停药后恢复28天），每组12只。造模结束后各组大鼠均行听性脑干反应（ABR）检测，然后断头处死并迅速取出听皮层，运用实时荧光定量PCR技术及Western-blot技术分别检测三组大鼠听皮层中TrkB及c-fos的表达。结果正常组ABR反应阈为36±2.23 dB SPL，慢性组反应阈升高为41.3±3.31 dB SPL，与正常组比较，差异有显著统计学意义（P＜0.01）；慢性恢复组ABR反应阈为38.6±5.51 dB SPL，与正常组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。慢性组听皮层c-fos mRNA表达为1.24±0.09，蛋白的表达为0.70±0.12，慢性恢复组听皮层c-fos mRNA的表达为1.23±0.04，蛋白的表达为0.68±0.08，两组均高于正常组（分别为1.12±0.05、0.50±0.04），差异有统计学意义（P＜0.01）。慢性组听皮层TrkB mRNA表达为1.26±0.10，蛋白的表达为1.85±0.17，慢性恢复组听皮层Trk B m RNA表达为1.23±0.07，蛋白的表达为1.80±0.08，均高于正常组（分别为1.11±0.03，1.53 ±0.16），差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 长期注射水杨酸钠后大鼠听皮层c-fos基因表达升高，可能与听觉中枢神经活动增强有关；长期注射水杨酸钠可能通过上调大鼠听皮层Trk B的表达，增强听皮层神经营养因子的功能促进听皮层功能重塑。

水杨酸钠； 酪氨酸受体激酶B； c-fos基因

水杨酸钠制剂在临床上被广泛用于治疗慢性炎性疾病，但其大剂量使用时可产生明显的耳毒性副作用。长期以来学者们对水杨酸钠的耳毒性进行了大量的研究，从听觉系统的不同层面（包括中枢和外周）探讨了水杨酸盐耳毒性及其导致耳鸣的机制［1～3］。前期研究发现，急性水杨酸钠注射后动物畸变产物耳声发射（DPOAE）幅值出现可逆性降低，而长期水杨酸钠注射的耳鸣模型动物DPOAE幅值逐渐升高且为可逆性的［4］，耳蜗神经电生理活动平均谱（ASECA）幅值逐渐上升［5］；慢性注射水杨酸钠使大鼠耳蜗prestin表达上调［6］。这些研究从外周机制上对慢性注射水杨酸钠致耳鸣的机制作了深入探讨。然而，水杨酸钠的中枢效应同样不可忽视。研究表明，水杨酸钠能引起动物听觉通路神经元电活动的一系列改变［7～9］，同时，在对耳鸣患者的研究中也发现了听皮层神经元代谢活动增加和功能重组的证据［3］，说明听觉中枢尤其是听皮层功能活动的变化可能在耳鸣的产生中具有更为重要的作用。因此，本研究采用长期大剂量注射水杨酸钠建立耳鸣动物模型，通过观察其听皮层中与中枢神经系统的功能可塑性密切相关的c-fos基因以及与神经元修复再生密切相关的酪氨酸受体激酶B（Trk B）的表达及变化，进一步探讨水杨酸钠耳毒性的中枢机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 水杨酸钠购自美国Sigma公司，以生理盐水溶解，配成10%溶液；Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit购自美国Thermo公司；定量PCR试剂盒购自日本TOYOBO公司；Trk B、c-fos多克隆抗体均购自美国Santa公司，HRP标记山羊抗兔二抗购自KPL公司；ECL（enhanced chemiluminescence）化学发光底物购自武汉谷歌生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物分组及处理 选择健康成年Wistar大鼠36只（由湖北省预防科学院动物实验中心提供），雌雄不限，体重200～300 g，耳廓反射灵敏，无中耳感染、强噪声暴露及耳毒性药物应用史。适应性饲养一周后，将实验动物随机分为慢性组、慢性恢复组，正常对照组，每组12只。实验前均进行ABR检测，排除ABR反应阈大于40 dB SPL的动物。将水杨酸钠（Sigma公司，S2679）溶于生理盐水中配成10%溶液，慢性组动物肌肉注射水杨酸钠175 mg／kg，2次／天，时间间隔8小时，连续注射14天；慢性恢复组大鼠前期处理同慢性组，注射14天后停药，并恢复28天；正常对照组不予任何处理。造模结束后，检测各组大鼠ABR反应阈，然后断头处死并迅速剥离下丘，其中每组6只用于检验Trk B及c-fos mRNA的变化，另外6只用于检测Trk B及c-fos蛋白的改变。

1.2.2 ABR检测 大鼠经2%戊巴比妥钠50 mg／kg腹腔注射麻醉后，保持肛温37℃并置于隔声屏蔽室内进行检测。选用短声（click）作为刺激声，单耳刺激，耳机发声窗距外耳道口1 cm，刺激速率为21次／秒，带通滤波100～3 000 Hz，观察时程为10 ms，叠加次数1 024次。记录电极置于两侧外耳道口与颅正中线交叉处皮下，参考电极置于同侧耳乳突皮下，接地电极置于鼻尖正中皮下。测试声强从110 dB SPL开始，以5 dB逐次递减，以波Ⅲ最后消失的上一强度作为ABR反应阈。

1.2.3 RT-PCR检测听皮层Trk B及c-fos表达 各组大鼠处死剥离的听皮层立即放入液氮中，随后转入-80℃冰箱保存。样品收集完后采用Trizol法分别提取总RNA，紫外分光光度计测定其浓度计纯度。根据Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒说明书进行cDNA的合成，反应条件为：42℃30分钟，80℃5分钟，将c-DNA产物置于-20℃保存。在Genbank数据库中查找大鼠TrkB及c-fos基因序列，使用primer5.0软件设计大鼠目的基因及内参β-action引物，交由Invitrogen公司合成（表1）。RT-PCR反应扩增

条件为：95℃预变性1分钟，95℃变性15秒，58℃退火15秒，72℃延伸20秒，进行40个循环。各基因表达变化采用比较阈值法即2-△△Ct法计算。

表1 大鼠Trk B及c-fosβ-action引物序列

1.2.4 Western blot检测听皮层Trk B及c-fos蛋白表达 标本分别加入适当体积组织裂解液后冰上彻底匀浆，离心后取上清液。采用Bradford方法测定蛋白浓度，各组取总蛋白40μg上样经10% SDS-PAGE凝胶电泳分离后转移至PVDF膜，用含5%脱脂奶粉的TBST封闭液室温封闭1小时，将PVDF膜分别浸泡于兔抗鼠Trk B多克隆抗体（1：1 000）、兔抗鼠GABAAα1多克隆抗体（1： 1 000）、兔抗鼠c-fos多克隆抗体（1：1 000）4℃过夜，TBST洗涤5 min×3次，加入HRP标记羊抗兔二抗（1：3 000）室温下孵育30分钟，TBST洗涤5 min×3次，在暗室内加入ECL化学发光底物曝光，最后用显影、定影试剂进行显影和定影。选用βaction的表达量为参照标准，并用Alpha软件处理系统分析结果，以光密度比值作为相对表达量。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0统计学软件进行数据分析，组间比较采用独立样本t检验，组内比较采用配对样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ABR检测结果 造模完成后，慢性组ABR反应阈升高为41.3±3.31 dB SPL，与正常组比较，差异有显著统计学意义（P＜0.01）；慢性恢复组ABR反应阈为38.6±5.51 dB SPL，与正常组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表2）。

表2 三组大鼠ABR反应阈、c-fos和TrkB mRNA及其蛋白的表达（±s）

表2 三组大鼠ABR反应阈、c-fos和TrkB mRNA及其蛋白的表达（±s）

注：与正常组比较，△P＜0.01，*P＜0.05

组别ABR反应阈（dB SPL）c-fos mRNA c-fos蛋白TrkB mRNA TrkB 蛋白正常组36.0±2.23 1.12±0.05 0.50±0.04 1.11±0.03 1.53±0.16慢性组41.3±3.31△1.24±0.09*0.70±0.12*1.26±0.10*1.85±0.17*慢性恢复组38.6±5.51 1.23±0.04*0.68±0.08*1.23±0.07*1.80±0.08*

2.2 听皮层TrkB及c-fos mRNA表达 三组大鼠听皮层中均可检测到Trk B、c-fos m RNA的表达，慢性组及慢性恢复组听皮层中c-fos及Trk B m RNA的表达均高于正常组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表2）。

2.3 听皮层c-fos及Trk B蛋白表达情况 Western blot结果显示，慢性组及慢性恢复组听皮层cfos及Trk B蛋白的表达量均高于正常组，差异有统计学意义（P＜0.05）（图1，表2）。

3 讨论

动物学实验证实，长期注射水杨酸钠是一种建立耳鸣动物模型的有效方法［10，11］。本研究结果显示，慢性水杨酸钠注射后动物ABR反应阈升高，而慢性恢复组动物ABR反应阈与正常组比较差异无统计学意义，表明本实验所采用的慢性造模方法能够引起实验动物可逆性的听力损失。Hu等［11］运用与本研究类似的方法（长期腹腔注射水杨酸钠，200 mg／kg，2次／天，间隔8小时）建立动物模型后，应用听觉惊跳反射的间隔前冲动抑制（gap pre-pulse inhibition of acoustic startle，GPIAS）法对大鼠进行耳鸣行为学检测，结果发现，慢性腹腔注射水杨酸钠3、7和14天后的动物有耳鸣行为学表现。

c-fos基因是一种快反应基因，c-fos基因的表达可以反映中枢神经系统功能活动的变化［12］；在静止细胞受到各种刺激时c-fos迅速表达，已证实异常感觉刺激或神经元的异常电活动可以导致中枢相应功能区c-fos基因表达增多，并认为与中枢神经系统的功能可塑性有关［13］。本研究结果显示，长期注射水扬酸钠的慢性组大鼠听皮层中c-fos的表达增加，结合类似造模方法的动物行为学研究文献［10，11］，推测长期大剂量注射水杨酸钠能够引起动物听觉中枢神经元活动增强，并出现类似耳鸣的表现。慢性恢复组中c-fos表达仍高于正常组，差异有统计学意义（P＜0.05），说明长期注射水杨酸钠

导致的听力损失恢复后，听皮层有可能仍然处于兴奋状态，从而表现出耳鸣的持续存在，此有待进一步实验验证。

脑源性神经营养因子（BDNF）是神经营养因子家族中最重要的一员，酪氨酸受体激酶B（Trk B）是Trk受体的一种，BDNF与神经元细胞膜特异性受体Trk B结合，导致受体二聚化和自身磷酸化，使受体具有生物活性，从而激发细胞内信号瀑布，包括丝裂源活化蛋白激酶通路（MAPK）、磷酸肌醇-3-激酶（PI3K）通路等，这些通路均在突触活动相关蛋白翻译与转运过程中起着关键作用［14］。因此，BDNF-Trk信号传导通路被认为对神经元的存活、生长、形态和功能的可塑性等起着重要的作用。本研究结果显示，慢性注射水杨酸钠组Trk B mRNA及蛋白的表达均高于正常组，差异有统计学意义（P＜0.05），说明长期注射水杨酸钠后，听皮层中出现更多的Trk B受体，通过与BDNF结合，可能参与中枢重塑的过程。

有研究发现，大剂量注射水杨酸钠后，听皮层中低频特异性调谐区域的神经元细胞上移，而高频特异性调谐区域的神经元细胞下移，从而导致听皮层中频代表区域（10～20 k Hz）扩大，表现出功能的重组，而这种重组与水杨酸钠引起的可觉察耳鸣的频率一致［15］。结合本研究结果，推测在给动物慢性注射水杨酸钠过程中，可能有更多的BDNF与神经元轴突末梢Trk B结合并逆行运输至胞体，维持神经元的生理功能及突触传递，并促进听皮层神经元功能重塑，其具体机制有待进一步设计更加完善的实验加以验证。

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（2014-10-10收稿）

（本文编辑 雷培香）

Effects of Long Term Administration of Sodium Salicylate on the Expression of TrkB and c-fos in Rat Auditory Cortex

Li Jinxiu，Yang Kun，Wu Sha，Hua Qingquan
（The Department of Otolarygology Head and Neck Surgery，Renmin Hospital of Wuhan University，Whuhan，430060，China）

Objective To study the expression of TrkB and c-fos in rat auditory cortex after long-term administration of sodium salicylate and the mechanisms of salicylate ototoxiclty.Methods Normal adult rats were divided into three groups：normal group without any treatment，long-term treatment group given i.m.injections，175 mg／kg，twice daily at 9：00 am and 6：00 pm for consecutive 14 days and the recovered group using the same method as the chronic group except that they were sacrificed 28 days after salicylate treatment ceased.After the detection of ABR，rats were sacrificed after deep anesthesia，and the auditory cortexes were dissected rapidly.Realtime PCR and Western-blot were explored to detect the expression of TrkB and c-fos.Results The average ABR threshold of normal rats was 36±2.23 dB SPL.The average ABR threshold of long-term group was 41.3±3.31 dB SPL，which was significantly increased than normal group（P＜0.01）.The average ABR threshold of the recovered

Sodium salicylate； Receptor tyrosine kinase pathway（TrkB）； c-fos

10.3969／j.issn.1006-7299.2015.03.016

时间：2015-3-3 14：39

R764.5

A

1006-7299（2015）03-0276-04

* 国家自然科学基金青年基金（81100712）资助

1 武汉大学人民医院耳鼻咽喉头颈外科（武汉 430060）

李锦秀，女，湖北人，主治医师，在职硕士，主要研究方向为耳科学。

华清泉（Email：hqqrm@sina.com）；杨琨（Email：bluee_kyoung@163.com）

网络出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／42.1391.R.20150303.1439.019.html

group was 38.6±5.51 dB SPL.There were no differences between the recovered group and normal group（P＞0. 05）.The expression of c-fos mRNA（1.24±0.09）and protein（0.70±0.12）in the long-term group were significantly increased，when compared with the normal group.The c-fos m RNA（1.23±0.04）and protein（0.68±0.08）expression in the recovered group were also significantly increased compared with the normal group.The expression of Trk B mRNA（1.26±0.10）and protein（1.85±0.17）in the long-term group were significantly increased，when compared with the normal group.The TrkB m RNA（1.23±0.07）and protein（1.80±0.08）expression in the recovered group were also significantly increased compared with the normal group.Conclusion The inereased expression of c-fos in the long-term group may be related to the enhancement of central auditory function.The inereased expression of Trk-B in the long-term group might be involved in instability of synaptic plasticity in tinnitus.