m Ab-EGFR功能化修饰的纳米金棒靶向光热作用对下咽癌FADU细胞株和293T细胞株的温度影响△

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·实验研究·

m Ab-EGFR功能化修饰的纳米金棒靶向光热作用对下咽癌FADU细胞株和293T细胞株的温度影响△

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目的 探讨上皮生长因子受体单克隆抗体（epidermal growth factor receptor monoclonal antibody，m Ab-EGFR）功能化修饰的纳米金棒靶向光热作用对下咽癌FADU细胞株和非肿瘤细胞的温度影响。方法 在CTAB体系下合成实验所需纳米金棒并完成上皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）单克隆抗体功能化修饰，用紫外分光光度计及电镜表征；以体外培养的下咽癌FADU细胞和非肿瘤细胞293T细胞系为实验材料，用western blot免疫印迹法定性比较两株细胞EGFR的表达及明确细胞内吞纳米金棒；Annexin-5／PI双染法荧光显微镜观察FADU细胞和293T细胞凋亡情况；设定不同剂量纳米金浓度（15%、25%、35%），应用808 nm波长近红外激光照射6分钟，每隔一分钟检测细胞培养介质温度，并用XTT法检测细胞存活率。结果 纳米金棒浓度在15%～25%、近红外激光照射6分钟时，细胞温度为41～43℃，并且趋于稳定，对下咽癌细胞有明显的杀伤作用（P＜0.05），而对293T细胞没有明显的杀伤作用，而纳米金棒浓度在35%时对下咽癌FADU细胞和293T细胞都具有明显的杀伤作用（P＜0.05）。结论 浓度为15%～25%m Ab-EGFR功能化修饰的纳米金棒在近红外激光照射6分钟时细胞温度升至41～43℃，对下咽癌细胞具有明显的杀伤作用，而对非肿瘤细胞无明显损伤。

上皮生长因子受体单克隆抗体； 纳米金棒； 下咽癌FADU细胞株； 细胞温度

纳米金是一种具有近红外吸收和散射功能的贵金属纳米材料，纳米金的表面等离波子共振效应能使纳米金棒产生热能，即纳米金在近红外激光下的光热效应。肿瘤细胞代谢异常，在细胞膜的表面可产生过表达的特异性蛋白，纳米金粒子能够以较强的亲和力与抗体或蛋白质、DNA片段形成共轭物种，这些物种选择性的或通过免疫介导靶向结合在肿瘤细胞膜表面上，增加恶性肿瘤治疗的准确性。纳米金棒的共轭物种也会吸收连续波激光器发射出的近红外照射（near infrared radiation，NIR），把吸收的光能转换成大量的热能，这些瞬间散发的热量足够有效的轰击肿瘤细胞而不会损伤周围的正常细胞，从而达到使癌细胞凋亡的目的。头颈部恶性肿瘤中上皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）检出率高达98.3%［1］，为纳米金棒靶向治疗头颈部恶性肿瘤提供可能。下咽癌是发生在喉咽部的恶性肿瘤，多以鳞状细胞癌为主，其治疗以手术切除加术后放化疗为主，然而因为其具有很高的耐药和转移特性，所以预后很差，5年生存率在40%左右［2，3］。本实验分析EGFR功能化修饰的纳米金棒在近红外激光的激发下对恶性和正常细胞株的温度影响，探索纳米金棒治疗恶性肿瘤的可行性，为新型的肿瘤治疗方法提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 下咽癌FADU细胞株（购自中科院上海细胞库），人肾上皮细胞293T细胞株（昆明动物研究所），纳米金棒（λ＝800 nm，吸光度为1.3）（昆明贵金属研究所），鼠抗人EGFR单克隆抗体（美国SIGMA公司），808 nm波长激光发生器。主要试剂为：MEM培养基（GIBCO公司，美国），胎牛血清（FBS）（GIBCO公司，美国），0.25%胰蛋白酶，羊抗小鼠IgG（ABMART公司，上海），Annexin-5／PI双染试剂盒（Roche公司，美国），XTT试剂盒（Roche公司，美国），温度测量仪：TM-902C测温表，购自北京圣达骏业科技有限公司。

1.2 实验分组 FADU细胞和293T细胞均设m Ab-EGFR／Au（金）+NIR组，Au+NIR组，m Ab-EGFR／Au组，Au组，NIR组，m Ab-EGFR组，空白对照组。加入m Ab-EGFR／Au及Au的浓度均设置为15%、25%、35%（近红外激光照射为NIR）。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养 使用10%胎牛血清-MEM培养基，将FADU细胞置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱内培养，平均每2～3 d传代1次。

1.3.2 纳米金棒的合成、表征 ①在存在CTAB诱导试剂的水溶液体系中，研究利用热化学或光化学还原HAuCl4生长纳米金棒方法。②anti-EGFR／Au共轭物的制备。调节纳米金溶液的p H值为7.4，将纳米金颗粒置于20 mmol HEPES（羟乙基哌嗪乙磺酸）缓冲液（p H＝7.4）中，直到所得溶液在800 nm处的光密度为0.8。将不同浓度鼠抗人EGFR单克隆抗体溶液分别稀释到HEPES缓冲液中，形成500μl稀释液，然后取上述制得的不同浓度单克隆抗体溶液与10 ml纳米金溶液混合30分钟。随着anti-EGFR抗体浓度的增加，用美国Lambda900紫外可见光谱仪扫描，出现纳米金溶液最大光吸收峰值不变时，进入吸收峰值平台的初始浓度即为所需最佳鼠抗人EGFR单克隆抗体浓度。取该浓度混合物溶液10 ml加入0.5 ml 1%的聚乙二醇中作用10分钟后，在低温下离心，得到anti-EGFR／Au共轭物，加入PBS缓冲液中（p H＝7.4），制备分散良好的稳定的anti-EGFR／Au共轭物溶液，4℃下保存备用。

1.3.3 应用激光共聚焦显微镜观察细胞与纳米金棒的相互作用 使用激光共聚焦显微镜专用培养皿（型号：P35G-1.5-14-C，美国康宁），将FADU细胞和293T细胞消化、计数后以5×105个放置于专用培养皿，置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱内培养，10%胎牛血清-MEM培养基，36小时后取出，弃培养基，加入3 ml纳米金棒溶液后放置于CO2孵箱约45分钟后，用激光共聚焦显微镜（Leica SP5）以633激光器488 nm激发波长观察纳米金棒富集于细胞的情况。

1.3.4 Western blot法检测FADU细胞株及293T细胞EGFR的表达 用RIPA蛋白裂解液提取蛋白，以常规Western blot方法检测细胞EGFR蛋白的表达，以β-actin为内参，做EGFR蛋白条带吸光度定性分析，比较FADU细胞株及293T细胞EGFR的表达的差异。

1.3.5 Annexin-5／PI双染法荧光显微镜观察FADU细胞和293T细胞凋亡 选用处于对数生长期的常规培养细胞消化传代，调整细胞密度为2.0 ×105／m L，将FADU下咽癌细胞接种于24孔培养板中（培养基容量为1 000μl），加入150μl、250μl及350μl m Ab-EGFR功能化修饰的纳米金棒及近红外激光处理6 min后，每孔加入100μl Annexin-5／PI荧光染色剂，室温下孵育20 min，于激发波长488 nm荧光纤维镜下定性观察细胞凋亡情况。

1.3.6 测量温度 选用处于对数生长期的常规培养细胞消化传代，调整细胞密度为1.4×105个／ml，将FADU下咽癌细胞和293T细胞接种于96孔培养板中，培养24小时后，弃培养基，每孔加入检测培养基（1%FBS+MEM）和纳米金棒溶液共100μl，按比例分别加入15、25、35μl纳米金溶液，其余用检测培养基补齐，此时，纳米金的浓度为15%、25%、35%。每个样本设3次重复。置于CO2孵箱约45分钟后，用808 nm激光发生器5 W／cm2将m Ab-EGFR／Au+NIR组和Au+NIR组照射6分钟，每隔一分钟测定细胞培养介质温度并记录。

1.3.7 XTT法检测细胞存活率 完成温度测量后，即照射6分钟后，将XTT反应显色液加入96孔板中（按说明书操作），每孔50μl，放置于37℃、5% CO2饱和湿度培养箱内培养18小时后于酶标仪读板（波长480 nm，参考波长650 nm）。

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0统计分析软件对各组数据进行非参数秩和检验，不同处理因素间进行随机区组方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 m Ab-EGFR功能化修饰的纳米金棒的表征

将制备好的纳米金棒溶液放于比色皿中，在紫外分光光度计（美国Lamda 900）中以400～1 000 nm波长紫外光扫描对功能化修饰的纳米金棒进行表征和电镜表征见图1和图2。

从图1可见制备好的纳米金棒最大吸收峰位于800 nm位置，经m Ab-EGFR修饰后，纳米金棒的最大吸收峰向右移动，峰值为812 nm。图2示将纳米金溶液滴于铜网表面，干燥后于透射电镜下15万倍观察，可见纳米金棒分散性良好，纵横比大约为3.9，符合实验要求。

2.2 Western blot免疫印迹法检测EGFR在FADU下咽癌细胞及293T细胞中的表达 Western-blot结果见图3。可见，FADU细胞在170 KD条带上可以明显看到蛋白表达，293T细胞在170 KD条带位置上未见表达，β-actin表达清晰。

图1 纳米金棒紫外吸收峰光谱图

图2 纳米金棒电镜表征图（×150 000）

图3 Western blot法检测EGFR在FADU细胞和293T细胞表达电泳图

2.3 激光共聚焦显微镜观察纳米金棒富集于细胞

用激光共聚焦显微镜（Leica SP5）以633激光器488 nm激发波长观察纳米金棒富集于细胞情况如图，图中红色的部分为纳米金棒的富集部位（图4）。

2.4 Annexin-5／PI双染法荧光显微镜定性观察FADU细胞和293T细胞凋亡，如图5～12，绿染为细胞凋亡，红染为细胞坏死。

图4 纳米金棒富集于细胞情况

图5 15%m Ab-EGFR／Au+NIR作用FADU细胞后细胞凋亡（×10）

图6 25%m Ab-EGFR／Au+NIR作用FADU细胞后细胞凋亡（×10）

图7 35%m Ab-EGFR／Au+NIR作用FADU细胞后细胞凋亡（×10）

图8 未经处理FADU细胞凋亡（×20）

图9 15%m Ab-EGFR／Au+NIR作用293T细胞后细胞凋亡（×10）

图10 25%m Ab-EGFR／Au+NIR作用293T细胞后细胞凋亡（×20）

图11 35%m Ab-EGFR／Au+NIR作用293T细胞后细胞凋亡（×10）

图12 未经处理的293T细胞凋亡（×10）

2.5 m Ab-EGFR功能化修饰纳米金棒光热作用对下咽癌FADU细胞及293T细胞温度变化影响见表1～3。

表1 m Ab-EGFR／Au+NIR组293T细胞和FADU细胞不同纳米金浓度时温度变化情况（℃，±s）

表1 m Ab-EGFR／Au+NIR组293T细胞和FADU细胞不同纳米金浓度时温度变化情况（℃，±s）

作用时间（分）293T细胞培养介质温度15%纳米金 25%纳米金 35%纳米金FADU细胞培养介质温度15%纳米金 25%纳米金 35%纳米金0 15 25.67±0.58 25.00±0.00 1 28.00±0.00 33.33±0.58 36.00±1.73 30.00±1.00 33.00±0.00 34.67±0.58 2 32.67±0.58 37.67±2.31 42.33±0.58 32.67±2.52 38.33±0.58 38.67±0.58 3 34.67±1.53 40.33±1.53 46.33±0.58 35.00±1.00 41.33±1.15 42.67±0.58 4 37.33±3.06 43.00±2.00 51.00±1.73 39.67±0.58 46.00±1.00 47.00±2.00 5 39.67±5.03 44.00±1.73 53.33±1.53 43.67±1.53 49.67±0.58 51.67±2.08 6 41.00±4.58△44.33±1.15△58.00±2.00*△45.33±0.58△51.00±1.00△55.33±0.58 24.33±1.15 25.67±0.58 25.00±0.00 24.33±1. *△

表2 Au+NIR组293T细胞和FADU细胞不同纳米金浓度时温度变化情况（℃，±s）

表2 Au+NIR组293T细胞和FADU细胞不同纳米金浓度时温度变化情况（℃，±s）

注：*与相同时间、同类15%、25%m Ab-EGFR／Au+NIR处理组比较，P＜0.001；△与相同浓度不同时间比较，P＜0.01；※与相同剂量浓度条件下m Ab-EGFR／Au+NIR处理组（表1）比较，P＜0.01

作用时间（分）293T细胞培养介质温度15%纳米金 25%纳米金 35%纳米金FADU细胞培养介质温度15%纳米金 25%纳米金 35%纳米金0 00 26.00±0.00 27.33±2.31 1 30.33±0.58 30.68±0.58 35.67±0.58 31.00±0.00 33.67±0.58 36.00±0.00 2 33.00±1.00 33.33±1.15 38.67±0.58 34.00±0.00 36.00±0.00 38.00±0.00 3 36.00±0.00 35.00±0.00 36.67±0.58 36.00±0.00 40.67±1.15 40.00±0.00 4 37.67±0.58 37.00±0.00 38.67±0.58 38.00±0.00 44.00±0.00 42.67±0.58 5 38.67±1.53 37.33±0.58 39.67±0.58 39.00±0.00 45.00±0.00 46.00±0.00 6 41.00±1.00△37.67±0.58△41.33±0.58*△41.33±1.15△※46.33±1.15△※47.33±0.58 25.67±0.58 28.00±2.00 25.67±0.58 26.00±0. *△※

表3 不同作用时间下各处理组293T细胞和FADU细胞温度变化情况（℃，±s）

表3 不同作用时间下各处理组293T细胞和FADU细胞温度变化情况（℃，±s）

注：*与表1及表2中相同时间比较，P＜0.01

作用时间（分）293T细胞培养介质温度mAb-EGFR／Au Au mAb-EGFR NIR 空白对照FADU细胞培养介质温度mAb-EGFR／Au Au mAb-EGFR NIR 空白对照0 24.02±0.15 24.08±0.34 24.00±0.30 24.02±0.50 24.00±0.40 24.00±0.15 24.05±0.58 24.00±0.76 24.02±0.06 24.00±1.49 1 24.05±0.87 24.00±0.59 24.34±0.32 24.23±0.09 24.50±0.85 24.43±0.76 24.27±0.39 24.13±1.50 24.06±0.79 24.30±0.87 2 24.09±0.35 24.10±0.40 24.10±0.31 24.00±0.04 24.79±1.23 24.13±0.15 24.09±0.60 24.11±0.90 24.45±0.54 24.20±1.59 3 24.05±0.12 24.07±0.61 24.00±0.76 24.56±0.46 24.70±0.40 24.00±0.13 24.23±0.03 24.20±1.32 24.47±0.25 24.00±2.02 4 24.03±0.45 24.35±0.46 24.14±0.56 24.08±0.08 24.00±0.89 24.08±0.16 24.18±0.47 24.23±1.67 24.43±1.36 24.30±1.67 5 24.23±0.33 24.42±0.43 24.23±0.34 24.34±0.78 24.00±1.67 24.41±0.20 24.10±0.75 24.50±0.75 24.45±0.73 24.60±1.10 6 24.20±0.21*24.40±0.56*24.30±0.98*24.35±0.95*24.10±1.58*24.33±0.20*24.00±0.23*24.50±1.42*24.52±1.32*24.34±1.97*

m Ab-EGFR功能化修饰的纳米金棒对于下咽癌FADU细胞和293T细胞在近红外激光的照射下都表现为照射时间越长，温度越高，照射时间为5至6分钟时，温度相对恒定（表1）；未经m Ab-EGFR功能化修饰的纳米金棒对于下咽癌FADU细胞和非肿瘤细胞293T细胞在近红外激光的照射下也表现为照射时间越长，温度越高，照射5至6分钟时温度相对恒定（表2）；并且相同剂量条件下m Ab-EGFR功能化修饰的纳米金棒对于下咽癌FADU细胞和293T细胞在近红外激光的照射下与未经m Ab-EGFR功能化修饰的纳米金棒相比较产热温度更高（表1与表2比较）。未经近红外激光照射的纳米金棒（m Ab-EGFR／Au）、单独近红外激光照射（NIR）、单克隆抗体（m Ab-EGFR）本身及空白对照组不会使细胞产生热量，各处理组温度差异无统计学意义（P＞0.05）（表3）。

2.6 XTT法检测m Ab-EGFR功能化修饰纳米金棒光热作用对FADU下咽癌细胞及293T细胞存活率影响 在m Ab-EGFR功能化修饰纳米金棒光热作用下FADU细胞的存活率明显下降，且纳米金浓度越高对FADU细胞的杀伤程度越大，与空白对照组比较，FADU肿瘤细胞的存活率明显降低（P＜0.001），浓度为15%组与25%组293T细胞存活率相比较差异无统计学意义（P＞0.05），但35%纳米金浓度对293T细胞杀伤明显（P＜0.001）（表4）。下咽癌FADU细胞EGFR单克隆抗体处理组细胞增殖率较空白对照组明显下降（P＜0.01），而m Ab-EGFR组293T细胞增殖率与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），单纯NIR处理条件下FADU及293T细胞的增殖率与空白对照组比较差异均无统计学意义（P＞0.05），表明EGFR单克隆抗体对下咽癌细胞有一定杀伤协同效应，对293T细胞无明显杀伤作用，单独NIR对FADU及293T细胞均无明显杀伤作用（表5）。

表4 不同处理条件下293T细胞和FADU细胞在不同浓度纳米金作用下的增殖率（%，±s）

表4 不同处理条件下293T细胞和FADU细胞在不同浓度纳米金作用下的增殖率（%，±s）

注：*与15%、25%m Ab-EGFR／Au+NIR处理组比较，P＜0.001；△与表5中空白对照组数据比较，P＜0.001

处理条件293T细胞增殖率15%纳米金 25%纳米金 35%纳米金FADU细胞增殖率15%纳米金 25%纳米金 35%纳米金m Ab-EGFR／Au+NIR 1.13±0.03 1.07±0.06 0.69±0.01*△0.92±0.03 0.90±0.01 0.59±0.07*△Au+NIR 1.04±0.06 1.10±0.13 0.53±0.03 0.95±0.05 0.94±0.04 0.47±0.03 m Ab-EGFR／Au 1.15±0.06 1.00±0.03 0.68±0.05 1.03±0.05 0.77±0.08 0.47±0.04 Au 1.16±0.02 0.82±0.03 0.56±0.02 1.07±0.06 0.77±0.02 0.53±0.02

表5 其他处理条件下293T细胞和FADU细胞增殖率（%，±s）

表5 其他处理条件下293T细胞和FADU细胞增殖率（%，±s）

注：*与FADU细胞空白对照组比较，P＜0.01

其他处理条件293T细胞增殖率FADU 细胞增殖率m Ab-EGFR 1.11±0.02 1.05±0.07*NIR 1.21±0.01 1.44±0.01空白对照1.22±0.01 1.40±0.01

3 讨论

纳米金粒子具有与尺寸和形状相关的可调光学特性。当纳米粒子直径远小于激发波长时，某一频率的电场将引起金属自由电子穿越纳米粒子时的相干振荡，这种振荡会导致电磁场中的吸收和散射增强，被称为表面等离波子共振，而纳米金的表面等离波子共振效应能使纳米金棒产生热能，即纳米金在近红外激光下的光热效应。

纳米金微粒能快速（大约1 ps）将吸收的光转化为热能，不同直径的纳米金颗粒具有吸收近红外线发热的特点，有研究使用抗体修饰中空纳米金颗粒，增强纳米金颗粒在肿瘤细胞的富集，然后采用红外线照射，通过光热疗法杀灭肿瘤细胞［4］。经近红外激光照射后，纳米金棒对从可见区到近红外区的强吸收特性使得光能可以高效地转换为热能，因此可以在局部范围进行激光选择性加热，这非常适合作为分子或细胞的靶向治疗。经蛋白质大分子修饰的纳米金棒的共轭物种也会吸收连续波激光器发射出的近红外低能量辐射，纳米棒把吸收的光能转换成大量的热，这些瞬间散发的热量足够有效地轰击肿瘤细胞而不会损伤周围的正常细胞组织，从而达到使癌细胞凋亡的目的。采用这种纳米金棒辅助激光热作用方法，可对癌细胞进行选择性破坏，而不损害正常细胞。

国外一系列研究［5～8］表明，用抗EGFR抗体与纳米金棒结合后，再与过表达EGFR的口腔鳞癌细胞共培养，发现纳米金棒大量聚集于癌细胞膜表面；以820 nm波长红外光、4 W／cm2能量照射时，纳米金棒吸收光能并以大量热能的方式有效地传递给环境细胞，这些热量甚至高到100℃以上，附着纳米金棒的恶性细胞只需比良性细胞一半的激光能量就能被杀死。本课题组在前期实验中应用LDH法（乳酸脱氢酶法）证实在体外实验中，功能化修饰的纳米金棒光热作用杀伤人咽部鳞癌的安全剂量为15%～25%，并且在此浓度剂量下对非肿瘤细胞没有明显的细胞毒性［9］。本实验中应用EGFR单克隆抗体修饰纳米金棒靶向光热作用于下咽癌FADU细胞株和2293T细胞株，可见纳米金棒富集于细胞后通过近红外激光照射（NIR）6 min后下咽癌FADU细胞和293T细胞均可以达到41～43℃，而且在照射5～6分钟时温度趋于稳定，短时间内纳米金棒产生的能量能有效地杀伤下咽癌FADU细胞；吸光度为1.3时，浓度为35%的m Ab-EGFR功能化修饰纳米金棒光热作用在杀伤下咽癌细胞的同时对良性细胞也有损伤；但浓度为15%～25%的m Ab-EGFR功能化修饰纳米金棒光热作用能够有效杀伤下咽癌细胞而对良性细胞损伤较小，与体外细胞毒性检测实验结果［9］相吻合，故认为在体外实验中，浓度为15%～25%的m Ab-EGFR功能化修饰纳米金棒光热作用对下咽癌细胞具有明显的靶向杀伤作用。

纳米金具有很好的组织相容性，对机体无毒，而且纳米金小于血管内皮的间隙，能够通过微血管和毛细血管进入组织细胞中。功能修饰化的纳米金棒具有较高的靶向性，可以在肿瘤组织内停留聚集［10］，在恶性肿瘤治疗和诊断方面开拓了新领域，在生物成像、癌症治疗等方面已经取得了较好的成绩。纳米金微粒与靶向抗体相结合，利用近红外激光产生光热效应为肿瘤的靶向治疗提供了新颖而有效的方法，今后将继续深入探讨其杀伤作用的相关基因与蛋白表达的变化，探索其杀伤肿瘤细胞的机制，为靶向治疗咽喉部恶性肿瘤提供实验依据。

1 Magne N，Pivot X，Bensadoun RJ，et al.The relationship of epidermal growth factor receptor levels to the prognosis of unresectable pharyngeal cancer patients treated by chemo-radiotherapy［J］.Eur J Cancer，2001，37：2169.

2 Hoffman HT，Karnell LH，Funk GF，et al.The national cancer data base report on cancer of the head and neck［J］.Arch Otolaryngol Head Neck Surg，1998，124：951.

3 Hoffman HT，Karnell LH，Shan JP，et al.Hypopharyngeal patient care evaluation［J］.Laryngoscope，1997，107：1005.

4 Bonner JA，Harari PM，Giralt J，et al.Radiotherapy plus cetuximab for squamous-cell carcinoma of the head and neck［J］.N Engl J Med，2006，354：567.

5 El-Sayed IH，Huang X，El-Sayed MA.Surface plasmon resonance scattering and absorption of anti-EGFR antibody conjugated gold nanoparticles in cancer diagnostics：applications in oral cancer［J］.Nano Letters，2005，5：829.

6 Huang X，El-Sayed IH，El-Sayed MA.Cancer cell imaging and photothermal therapy in the near-infrared region by using gold nanorods［J］.J Am Chem Soc，2006，128：2115.

7 Huang X，Jain PK，El-Sayed IH，et al.Determination of the minimum temperature required for selective photothermal destruction of cancer cells using immunotargeted gold nanoparticles［J］.Photochem Photobiol，2006，82：412.

8 El-Sayed IH，Huang X，El-Sayed MA.Selective laser photo-thermal therapy of epithelial carcinoma using anti-EGFR antibody conjugated gold nanoparticles［J］.Cancer Lett，2006，239：129.

9 张荧荧，何晓光，董守安，等.m Ab-EGFR功能化修饰的金纳米棒靶向光热作用对人咽鳞癌FADU细胞株和293T细胞株的细胞毒性分析［J］.临床耳鼻咽喉头颈外科杂志，2014，28：884.

10 Dipanjan P，Manojit P，Angana S.A facile synthesis of novel self-assembled gold nanorods designed for near-infrared imaging［J］.J Nanosci Nanotech nol，2010，10：8118.

（2014-05-30收稿）（本文编辑 李翠娥）

An Analysis of the Diversification of Cell Temperature of Photothermal Effects of Gold Nanorods Coated with mAb-EGFR on FADU Human Pharyngeal Squamous Cell Lines and Non-tumor Cells 293 T Cell Line

Zhang Yingying*，He Xiaoguang，Cong Linhai，Dong Shouan，Li Yuxiao，Zhong Ling，Wang Yu，Ding Yanli
（*The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Kunming，650032，China）

Objective To study the cell temperature on photothermal effects of gold nanorods coated with m Ab-EGFR targeted on FADU human pharyngeal squamous cell lines and non-tumor cells（293T cell line）.Methods CTAB gold nanorods were synthesized to complete the functional modifications of EGFR monoclonal antibody，with a UV spectrophotometer and electron microscopy characterization.The cultured FADU hypopharyngeal cells and non-tumor cells 293 T cell lines were expressed by western blot EGFR statutory comparison of two cell lines，cells to swallow the gold nanorods were observed.Cell apoptosis was observed by Annexin-V-FLUOS and propidium iodide.Then we set different doses of gold nanoparticles concentration（15%，25%，and 35%）.After 6minutes＇near-infrared laser irradiation（λ＝808 nm），the temperature was recorded once every minute，and cell viability was detected by XTT assay.Results After six minutes＇near-infrared laser irradiation，the cell temperature was 41℃～43℃，with 15%～25%of gold nanorods.The cell killing effects on hypopharyngeal were significant.The 293T cells did not show any damaging effects（P＜0.05），whereas the concentration of gold nanoparticles in 35%of hypopharyngeal FADU cells and 293T cells had significant cytotoxicity（P＜0.05）.Conclusion There were significant cell killing effects with 15%～25%gold nanorods coated with m Ab-EGFR in the near-infrared laser irradiation six minutes（Cell temperatures of both cell lines were 41℃～43℃）on hypopharyngeal FADU cell but not on non-tumor cells.

m Ab-EGFR； Gold nanorods； Hypopharyngeal cancer FADU cell lines； Cell temperature

10.3969／j.issn.1006-7299.2015.02.013

时间：2015-3-3 14：39

R739.6

A

1006-7299（2015）02-0170-06

△ 国家教育部博士点（博导类）基金课题（20125317110004）

1 昆明医科大学第一附属医院头颈外科（昆明 650032）； 2 昆明贵金属研究所

张荧荧，女，昆明人，博士研究生，讲师，主要研究方向为咽喉肿瘤。

何晓光（Email：hexg1018@163.com）

网络出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／42.1391.R.20150303.1439.012.html