张少君,罗时旋,赵 稷,侯 巍,高金波,滕 杨
(1.佳木斯市传染病院,黑龙江 佳木斯 154007;2.佳木斯大学,黑龙江 佳木斯 154007)
关黄柏中总黄酮的提取工艺及抗氧化活性研究①
张少君1,罗时旋2,赵 稷2,侯 巍2,高金波2,滕 杨2
(1.佳木斯市传染病院,黑龙江 佳木斯 154007;2.佳木斯大学,黑龙江 佳木斯 154007)
关黄柏;总黄酮;超声波萃取;抗氧化
黄柏原名“檗木”,始载于东汉《神农本草经》,为芸香科植物黄皮树(Phellodendron chinense Schneid.)或黄檗(Phellodendron amurense Rupr.)的干燥树皮。《中华人民共和国药典》将两者分开,前者习称“川黄柏”,后者习称“关黄柏”[1]。其主要化学成分有生物碱类、黄酮类、内酯类、萜类、甾醇类及挥发油类等[2]。据有关资料报道:关黄柏中的小檗碱具有降血压、降血糖、抗溃疡[3]的作用,关黄柏水提液具有抗痛风、抗菌、抗炎、解热作用[4]。本文旨在确定超声提取法提取关黄柏中黄酮类物质的最佳工艺并考察其体外抗氧化活性,为关黄柏的合理开发和利用提供一定的理论与实验依据。
1.1 材料与试剂
关黄柏购自佳木斯市民生药行(批号,20100125);1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、芦丁标准品均购自Sigma公司;三(羟甲基)氨基甲烷(邻苯三酚)购自天津市凯通化学试剂;焦性没食子酸购自国药集团化学试剂有限公司;其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
UV757CRT型紫外可见分光光度计(上海精密仪器有限公司制造);KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);FZ120微型植物粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司)。
1.3 关黄柏中黄酮类化合物的提取
1.3.1 单因素实验
超声波提取温度的考察:称取相同质量 5.0g的关黄柏粉末各 5份,加入体积分数为 80%的乙醇,料液比为15:1,分别在不同温度(30、40、50、60、70℃)下超声提取 20min,抽滤,将滤液补足损失的相应体积,摇匀。
超声波提取料液比的考察:方法同上,分别在不同料液比(5:1、10:1、15:1、20:1、25:1)下于40℃超声提取20min,考察料液比对提取率的影响。
提取时间的考察:方法同上,在料液比为20:1的条件下于40℃分别超声10、20、30、40、50、60min,考察超声提取时间对提取率的影响。
超声波提取乙醇体积分数的考察:方法同上,分别加入不同体积分数的乙醇溶液(50%、60%、70%、80%、90%),料液比为 15:1,在30℃ 下超声提取20min,察乙醇体积分数对提取率的影响。
1.3.2 正交实验
采用L9(34)正交表进行试验考察各因素对关黄柏中总黄酮提取率的综合影响,以获得优化的工艺条件。
1.4 关黄柏中总黄酮的含量测定
1.4.1 芦丁标准溶液的配制
准确称取20.0mg芦丁标准品,用体积分数95%的乙醇溶解后转移至50.0mL的容量瓶中,定容混匀。芦丁标准溶液的浓度为400mg/L。分别将其稀释到 16、32、48、64、80mg/L,分别精密移取1mL至25mL容量瓶中,再分别依次加乙醇 11.0mL,5%的NaNO2溶液1.0mL,摇匀,静置6min;10%的Al(NO3)3溶液1.0mL,摇匀,静置6min;5%的NaOH溶液10mL;最后用95%的乙醇定容至25mL,摇匀,静置15min。以95%的乙醇为空白对照,在波长500nm处测定吸光度A,可得到芦丁浓度(x)与吸光度(y)之间的关系曲线方程。
1.4.2 总黄酮提取率的计算
精密移取1mL提取液至25mL容量瓶中。按照1.4.1项下操作,以芦丁作参照计算关黄柏中总黄酮的含量。提取率按下式计算:
1.5 黄柏中总黄酮的体外抗氧化活性实验
样品溶液配制:从关黄柏的最佳工艺试验中所得的总黄酮提取液中分别取出1、1.5、2、2.5、3mL,用70%的乙醇定容至50mL,作为样品溶液备用。
关黄柏中的总黄酮清除OH·活性测定[5,6]:按照 Smirnoff 的方法,取不同浓度样品溶液2.00mL,依次加入9.00mmol/L FeSO41.00mL,9.00mmol/L 水杨酸-乙醇溶液2.00mL,8.80mmol/L H2O22.00mL,用蒸馏水补至7.00mL,于37℃下反应30min。紫外可见分光光度计在 510nm处测定吸光度 AX,平行测定三次。
清除率的计算公式:
2.1 单因素实验结果
提取温度对提取率的影响:不同温度(30、40、50、60、70℃)条件下,总黄酮提取率分别为1.9301%,1.8609%,2.0808%,2.2396%,2.3007%。结果表明,物质的提取率会随着温度的升高而增加,这是因为随着温度的增加,可溶性成分的溶解度和扩散系数增大,有利于浸提;但同时温度的升高还会导致某些不稳定物质的分解或转化和乙醇挥发,又会降低其提取率。所以,选择50、60、70℃作为超声波提取关黄柏中总黄酮正交试验的温度因素。
料液比对提取率的影响 不同料液比(5:1、10:1、15:1、20:1、25:1),总黄酮提取率分别为1.5409%,1.8273%,2.0401%,2.3457%,2.1989%。结果表明,关黄柏中总黄酮的提取率随着料液比的增加先增大然后略有下降,这可能是由于溶剂用量较大,溶剂本身对超声波有一定的吸收损耗,导致在限定的时间内提取率稍有下降。但考虑到成本,选择 10:1、15:1、20:1作为超声波提取关黄柏中总黄酮正交试验的料液比因素。
提取时间对提取率的影响 总黄酮的提取率会随着提取时间的增大而增加,考虑到提取效率,选择30、40、50min作为超声波辅助提取总黄酮正交试验的时间因素。
乙醇体积分数对提取率的影响:不同乙醇提价分数(50%、60%、70%、80%、90%),总黄酮提取率分别为1.7875%,1.7142%,1.6287%,1.8405%,1.5025%。结果表明,随着乙醇体积分数的增大,黄柏中总黄酮提取率先增大后下降。这是因为植物果实中的黄酮类物质大部分与糖结合成苷类,以糖配基的形式存在,少部分则以难溶于水或不溶于水的游离黄酮存在。所以随着乙醇体积分数的增大,部分酯溶性黄酮一并提取,但随着乙醇体积分数的升高,水溶性黄酮的溶解度降低,导致总黄酮提取率下降,所以选择体积分数为50%、60%、70% 的乙醇作为超声波提取关黄柏中总黄酮正交试验的因素。
2.2 正交实验结果
经过正交试验可知,料液比对关黄柏中总黄酮提取率的影响最大,温度对关黄柏中总黄酮提取率的影响最小;最佳提取工艺条件为提取温度50℃,料液比20:1,提取时间为40min,乙醇浓度为70%。
2.3 关黄柏中总黄酮的含量测定
2.3.1 芦丁标准曲线与回归方程
根据实验数据,绘制芦丁标准曲线下图所示,其线性回归方程为:y=0.0092x+0.0231,R2=0.9997,结果见图1。
图1 芦丁的标准曲线
2.3.2 总黄酮提取率的计算结果
在最佳工艺条件下,关黄柏中总黄酮的得率为2.31%。
2.4 体外抗氧化活性试验结果
表1 不同浓度总黄酮提取液对OH·自由的清除率
[1]简永耀,靳龙文.不同产地黄柏药材的质量分析[J].淮海医学,2007,25(6):5661
[2]郭书好,周明辉.川黄柏叶中黄酮成分的研究[J].暨南大学学报,1998,19(5):65-72
[3]MeskheliMB,AntelavaNA,BakuridzeAD,etal.AntidiabeticactivityofberberinandextractobtainedfromthebarkofPhellodendronlavalei,introducedinsubtropicregionsofGeorgia,instreptozotocininduceddiabeticrats[J].GeorgianMedNews, 2011(191): 53-60
[4]滕杨,谭天,罗时旋,等.关黄柏的超临界CO2萃取物成分分析及抗氧化性研究[J].中国现代应用药学,2014,31(27):824-827
[5]滕杨,侯丽然,侯巍,等. 木犀草素-铬配合物的合成及其清除DPPH自由基活性的研究.中国药房,2013,39(24):3666-3669
[6]葛明明, 缪月英,孙丽娜,等.蒲公英根多糖的抗氧化活性研究[J].黑龙江医药科学,2014,37(2):39-41
[7]滕杨,王雪,杜波涛,等.金银花的不同浓度醇提取物对DPPH清除作用的ESR研究[J].黑龙江医药科学,2011,34(6):43-44
[8]候巍,楚婧,候丽然,等.木犀草素与锌配合物的合成及其DPPH自由基清除活性的研究[J].黑龙江医药科学,2012,35(4):16-18
Study on extract technology and antioxidant activity of flavonoid from cortex phellodendri amurensis
ZHANGShao-Jun,LUOShi-Xuan,ZhaoJi,HOUWei,GAOJin-Bo,TENGYang
(Hospital of Infectious Diseases, Jiamusi University 154007, China)
Objective: To get the optimizing extraction technology and determine the vitro antioxidant activity of total flavonoids from cortex phellodendri Amurensis. Methods: The extract was obtained from cortex phellodendri Amurensis by ultrasonic extraction technology. orthogonal test method was used to establish the optimum extraction conditions. The scavenging activity on OH·,O-2·and DPPH free radicals were calculated with IC50 value. Results: The best extraction conditions were temperature 70℃, liquid ratio 20:1, extracting time 40min, ethanol concentration 70%.Under the above conditions, the extract rate of flavonoid was 2.31% and IC50 values of scavenging on the OH·,O-2·and DPPH free radicals were 2.9525mg/L, 1.6827mg/L and 1.3951mg/L. Conclusion: Ultrasonic extraction technology is safe and energy-saving to extract favonoids from cortex phellodendri Amurensis with high performance, and the favonoids has a strong antioxidant activity.
Cortex Phellodendri Amurensis; flavonoids; ultrasonic extraction;antioxidant activity
黑龙江省教育厅科学技术研究项目,编号:12523059。
杨少君(19~)男,黑龙江佳木斯人,硕士,主治医师。
滕杨(19~)女,黑龙江五常人,硕士,讲师。E-mail:tengyang19820405@163.com。
R284.2
A
1008-0104(2015)03-0011-03
2015-01-29)