兴奋性氨基酸对海马神经干细胞的损伤作用的实验研究①

刘 欣，胡国林，张 宇，齐志国

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003)



兴奋性氨基酸对海马神经干细胞的损伤作用的实验研究①

刘 欣，胡国林，张 宇，齐志国

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003)

目的：通过不同浓度谷氨酸对海马神经干细胞的致伤作用及其相关机制的研究，目的在于揭示兴奋氨基酸对神经发生的作用，为多种神经缺失性病变的修复提供可靠的实验依据。方法：取孕16d胎鼠神经干细胞培养，分为正常对照组、Glu高浓度组和Glu低浓度组。台盼蓝检测细胞死亡率，全细胞膜片钳记录。结果：100μmol/LGlu干预24h后有30%神经干细胞死亡，300μmol/LGlu干预24h后有70%的神经干细胞死亡。300μmol/LGlu干预24h后可诱导(1000.25±104.67)pA内向电流与正常对照组和100μmol/LGlu干预24h后相比有显著差异(P<0.01)。结论：随着谷氨酸浓度的增加，神经干细胞死亡率增加，同时细胞内向电流增大，可能是其死亡率增加的原因之一。

谷氨酸；胱氨酸；神经干细胞。

谷氨酸(glutamicacid，Glu)为中枢神经系统中重要的兴奋性神经递质，是脑组织中含量最高的一种氨基酸，参与多种生理功能的调控。正常情况下，Glu大部分存在于神经末梢内的Glu囊泡中，未梢去极化兴奋时，通过Ca2+依赖方式释放。但过量的Glu对神经有损伤作用。许多病理情况如癫痫、缺血、神经退行性疾病(帕金森病、肌萎缩侧索硬化症和阿尔兹海默症) 等都与谷氨酸兴奋毒性介导的神经细胞死亡密切相关[1]。

1 材料和方法

1.1 实验动物

孕16d胚胎鼠由佳木斯大学动物实验中心提供，分为正常对照组、高浓度谷氨酸组和低浓度谷氨酸组各10只。

1.2 方法

1.2.1 海马神经干细胞的培养：无菌操作取出海马组织，置于装有D-Hank's液的培养皿内返复冲洗，剪切为1mm3左右的组织块，用巴氏吸管反复吹打，制成单细胞悬液，1000rpm×5min离心，用神经干细胞基础培养液，并加入b-FGF吹打，分散制成单细胞悬液，经400目筛网过滤，去除细胞团块，取滤液，进行细胞记数，以3×104个/mL接种于25cm2培养瓶中，置于37℃，5%CO2培养箱中培养，每3～5d换半液，每天观察细胞生长情况。培养7～9d后进行试验[2]。

1.2.2 海马神经干细胞死亡率检测:称取台盼蓝4g，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100mL，滤纸过滤，PBS稀释至0.4%。胰酶消化贴壁的神经干细胞，制备单细胞悬液。细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液以9:1混合混匀，在3min内分别计数活细胞(未蓝染细胞)和死细胞( 蓝染细胞)。死亡率=蓝染细胞/( 蓝染细胞+未蓝染细胞)×100%，实验重复3次。

1.2.3 全细胞膜片钳记录：打开膜片钳放大器和数模转换器，将盛有贴壁细胞的培养皿倒置，通过显微镜和CCD图像传感器可视下挑选状态较好、突触完整边界折光度好的神经干细胞；在3-5MΩ电极电阻下高阻抗封接，形成全细胞记录模式，应用膜片钳放大器记录电流，2kHz滤波，采样频率为5kHz，PCLAMP-10软件进行数据记录和分析[3]。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 两种浓度的Glu对海马神经干细胞的影响的光学显微镜下的变化。正常传三代培养液中的海马干细胞在培养液中呈悬浮生长，细胞聚集成球，细胞呈圆形，细胞核大且有立体感，折光性强。在100μmol/LGlu干预24h后有一定数量细胞从细胞球中脱落，沉于培养瓶底，细胞无折光性，色暗，胞体变小，细胞内细胞无法辨认，有少许此种表现细胞附于细胞球外，使细胞球变形或是折光性差。而在 300μmol/LGlu干预24h后，此种表现更加明显。行台盼蓝计数细胞可见100μmol/LGlu干预24h后有30%神经干细胞死亡，300μmol/LGlu干预24h后有70%的神经干细胞死亡(P<0.01)。

2.2 两种浓度的Glu对海马神经干细胞膜电流的影响。在膜电位为- 70mV下记录到全细胞电流，100μmol/LGlu干预24h后可诱导(300.67±14.55)

pA内向电流与正常对照组(66.01±4.12)pA相比有显著差异(P<0.01)。300μmol/LGlu干预24h后可诱导(1000.25±104.67)pA内向电流与正常对照组和100μmol/LGlu干预24h后相比有显著差异(P<0.01)。

表1 不同浓度谷氨酸对海马神经干细胞致死率和内向电流的测定

a与正常对照组相比，P<0.01；b与100μmol/LGlu干预组相比，P<0.01。

3 讨论

兴奋性氨基酸作为神经递质其兴奋性毒性在神经细胞中的作用已经受到了极大的关注。其经受体作用持续活化神经细胞致神经细胞发生死亡或凋亡[4]。在兴奋性氨基酸中谷氨酸作为人体神经系统中含量最高、分布最广、作用最强的兴奋性神经递质，在人的胚胎初期，通过不均衡营养作用，造成基底神经节和边缘系统神经元数目的不适当增加。在一般情况下谷氨酸多数存在于神经突触的囊泡内，当神经末梢电位发生去极化时，囊泡与突触前膜结合，将其释放到突触间隙，与后膜特异受体结合，完成兴奋性突触传递，发挥其生理作用。研究表明[5]，当过量产生谷氨酸时，其在神经系统中表现的具有神经毒性的作用，即所谓的兴奋性毒性作用。当过量的谷氨酸与受体结合后，引起细胞Ca2+大量内流，使细胞内Ca2+超负荷，引起Ca2+稳态失调，从而激活依赖于钙的酶系统引起一系列的细胞损伤。这是认为较为经典的致伤途径。随着研究的进一步深入其神经毒性作用是多途径的，可通过抑制细胞膜上谷氨酸/胱氨酸转运体的功能产生细胞毒性作用[6]，该作用以细胞内谷胱甘肽耗竭和活性氧成分升高为主要特征，被称为谷氨酸的氧化毒性，对许多神经系统疾病的治疗具有重要意义。本研究就针对不同浓度的谷氨酸对海马区的神经干细胞的致伤作用的研究来明确其对神经发生有作用。随着谷氨酸浓度的增加，其引起神经干细胞死亡的能力增强。本实验通过光学显微镜观察到，300μmol/LGlu干预24h后细胞死亡率明显增加，细胞形态变化明显。Tan等[7]采用海马细胞系HT-22细胞，发现在BSO的作用下细胞内活性氧成分缓慢上升，而用谷氨酸后细胞内活性氧成分的升高24h后大部分的细胞死亡的研究结果相似。为了进一步明确其损伤机制，本研究应用膜片钳技术，行全细胞电压钳检测，对不同浓度的Glu干预24h后全细胞电流。实验结果表明，高浓度的谷氨酸更能引起更大的细胞内向电流。其内向电流是否为其致伤的主要因素，还需进一步研究。但内向电流的增大是比较明确的，内向电流是由什么离子跨膜运动形成的，有实验研究观察到，在正常膜电位时，除去细胞内K+或增加细胞外K+的浓度都能抑制神经胶质细胞对谷氨酸的摄取功能[8]。如使膜去极化，膜电位从-80mV降至-18mV，谷氨酸的摄取也显著下降。细胞内的K+可以用铯离子或铷离子来代替，而细胞外Na+的功能却相对特异，似乎没有其他离子能替代。钙离子的作用在其中还有待于进一研究。

[1]李晓娟，郭直岳，王亚莉，等.ATP受体通道激活增加谷氨酸对海马神经元的损伤[J]. 中风与神经疾病杂志，2013，10(30)：871-873

[2]VishwakarmaSK,BardiaA,TiwariSK,etal.Currentconceptinneuralregenerationresearch:NSCsisolation,characterizationandtransplantationinvariousneurodegenerativediseasesandstroke:Areview[J].JAdvRes，2014，5(3):277-294

[3]王显钢，汤华明，关政，等.膜片钳新进展及在体膜片钳技术[J].黑龙江医药科学，2005,28(2)：91-92

[4]TanJG1,LeeYY,WangT,etal.Heatshockprotein27overexpressioninCHOcellsmodulatesapoptosispathwaysanddelaysactivationofcaspasestoimproverecombinantmonoclonalantibodytitreinfed-batchbioreactors[J].BiotechnolJ,2014, 3:216-222

[5]LiN1,LiuB,DluzenDE,etal.ProtectiveeffectsofginsenosideRg2againstglutamate-inducedneurotoxicityinPC12cells[J].JEthnopharmacol，2007,111(3):458-463

[6]FregaM1,PasqualeV,TedescoM,etal.Corticalculturescoupledtomicro-electrodearrays:anovelapproachtoperforminvitroexcitotoxicitytesting[J].NeurotoxicolTeratol，2012, 34(1):116-127

[7]TanS1,SagaraY,LiuY,etal.Theregulationofreactiveoxygenspeciesproductionduringprogrammedcelldeath[J].JCellBiol，1998,141(6):1423-1432

[8]MarcaggiP1,HirjiN,AttwellD,etal.ReleaseofL-aspartatebyreversalofglutamatetransporters[J].Neuropharmacology，2005, 49(6):843-849

2014年佳木斯大学研究生科技创新项目,编号：LZR2014_17。

刘欣(1988～)女，黑龙江佳木斯人，在读硕士研究生。

齐志国(1972～)男，黑龙江佳木斯人，硕士，教授，主任医师，硕士研究生导师。E-mail：drqizhiguo@163.com。

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文章编号：1008-0104(2015)03-0050-02

2015-03-09)